復(fù)方樹莓籽粉對小鼠放射性脊髓損傷的防護(hù)作用

魯召翔 王金輝 徐 寧 欒 桀 逄翔宇 夏玉軍

1（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 青島266071）

2（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室 青島266071）

近年來，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，放射性診療的應(yīng)用越來越普遍［1］，如CT、PET/CT、γ 刀、介入治療、放射性核素治療等技術(shù)越來越多地應(yīng)用到臨床上。這也使得醫(yī)生和患者接觸放射性射線的概率大大提高［2］，特別是腫瘤的放射治療，會產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著腫瘤患者的預(yù)后和生存質(zhì)量［3］。放射性脊髓損傷是放療過程中一種罕見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，多見于頭頸部、上消化道、脊柱旁或脊髓等各種惡性腫瘤的放療后［4］，發(fā)生率約為0.85%～3.51%［5］。目前，臨床上有效方法不多，藥物治療主要有類固醇、鴉片拮抗劑（納絡(luò)酮），晚期則以康復(fù)治療為主［6］，因此早期預(yù)防極為重要。近些年，尋找有效的輻射防護(hù)劑成為研究熱點，但是能夠預(yù)防脊髓放射性損傷的藥物鮮有報道。復(fù)方樹莓籽粉的有效成分為原花青素、維生素C、維生素E 及微量元素等，具有抗氧化，減輕細(xì)胞損傷，延緩細(xì)胞凋亡等作用［7］。在小鼠的急性放射性脊髓損傷中也具有一定的防護(hù)作用［8］。本實驗將觀察復(fù)方樹莓籽粉作為輻射防護(hù)劑對小鼠放射性脊髓損傷的防護(hù)作用，為抗輻射藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及器材

復(fù)方樹莓籽粉（山東黑尚莓生物技術(shù)發(fā)展股份有限公司）；尼氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司）；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗小鼠Fas多克隆抗體（美國Proteintech公司）；兔抗小鼠caspase-9 多克隆抗體（美國Proteintech 公司）；山羊抗兔IgG 抗體（美國Abcam公司）；DAB試劑盒（北京中杉金橋公司）。

電熱恒溫水箱（HH.W21.420，北京科偉永興儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）；奧林巴斯顯微鏡；佳能EOS 600D相機。

1.2 動物分組

健康成年雄性昆明小鼠50 只，體質(zhì)量（20±2） g，購自濟(jì)南鵬悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK 魯2014-0007。隨機分為空白組、模型組、復(fù)方樹莓籽粉低濃度組、復(fù)方樹莓籽粉中濃度組、復(fù)方樹莓籽粉高濃度組，每組10只。以正常成人推薦量設(shè)置高濃度組，中濃度組、低濃度組分別為二分之一和四分之一推薦劑量。小鼠分籠后，于明暗12 h 交替、自由飲水進(jìn)食、濕度適宜、溫度（25±2）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3 動物處理及輻射損傷模型的建立

通過灌胃的方式分別對低、中、高濃度組進(jìn)行給藥，每組的劑量分別為37.5 mg/kg 體重、75 mg/kg 體重和150 mg/kg 體重。將復(fù)方樹莓籽粉溶解于1 mL 蒸餾水中，每只每天給藥一次，模型組給予1 mL 蒸餾水灌胃，空白對照組不做處理。第15 天，除空白對照組外，其余各組小鼠在灌胃后，即刻進(jìn)行一次性全身X 射線輻照。將小鼠放入邊長為20 cm，高度4 cm的盤盒內(nèi)，放置在醫(yī)用放療機輻射臺（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤科提供）上接受一次性全身輻照，輻射源距離小鼠100 cm，輻射視野80 cm×80 cm，吸收劑量率4 Gy/min，輻照時間1 min，總劑量為4 Gy，建立小鼠放射性脊髓損傷模型。照射結(jié)束之后繼續(xù)給藥直至實驗結(jié)束。

1.4 蘇木精-伊紅和尼氏染色

輻照后第3 天處死小鼠，取出脊髓于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，用切片機切成5 μm 和10 μm 的薄片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和尼氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.5 免疫組化(SABC)染色

取材固定包埋同HE染色，切片機切成3 μm的薄片，采用SABC法，二氨基聯(lián)苯胺顯色。以胞漿和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，光鏡下做定性觀察。在400 倍鏡頭下，每個樣本隨機選取5個視野拍照，用Image Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度進(jìn)行半定量分析［9］。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，p＜0.05時差異顯著，p＜0.01時差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 HE染色結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整，灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，間質(zhì)內(nèi)血管壁結(jié)構(gòu)完整清晰；模型組可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體縮小變形，核深染，核仁消失，嚴(yán)重者細(xì)胞核可溶解消失，少見衛(wèi)星現(xiàn)象，偶見噬神經(jīng)現(xiàn)象，還可見毛細(xì)血管擴張充血，并伴有炎細(xì)胞浸潤；低濃度組、中濃度組和高濃度組中，灰質(zhì)損傷明顯減輕，且隨復(fù)方樹莓籽粉濃度增加，損傷程度逐漸降低（圖1）。

圖1 脊髓灰質(zhì)HE染色，×400Fig.1 HE staining of spinal cord gray matter,×400

空白組白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列緊密有序，結(jié)締組織致密；模型組白質(zhì)中神經(jīng)纖維腫脹，結(jié)締組織疏松，原有組織結(jié)構(gòu)被破壞，并伴有炎細(xì)胞浸潤；低濃度組、中濃度組、高濃度組組織結(jié)構(gòu)破壞程度較模型組減輕，神經(jīng)纖維腫脹減輕，結(jié)締組織較致密，炎細(xì)胞浸潤減少。相比低濃度組，高濃度組損傷程度減輕（圖2）。

2.1.2 尼氏染色結(jié)果

尼氏染色結(jié)果顯示，空白組神經(jīng)元細(xì)胞飽滿，尼氏體數(shù)量較多，均勻分布于胞體中，胞體呈斑駁的藍(lán)紫色染色。模型組細(xì)胞內(nèi)尼氏體明顯減少，染色程度變淺。相比模型組，低濃度組、中濃度組、高濃度組中神經(jīng)元細(xì)胞染色逐漸加深，尼氏小體數(shù)量逐漸增多，見圖3。

圖2 脊髓白質(zhì)HE染色，×400Fig.2 HE staining of spinal cord white matter,×400

圖3 脊髓尼氏染色，×400Fig.3 Nissl staining of spinal cord,×400

2.1.3 免疫組化染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，空白組中偶見陽性細(xì)胞，模型組中可見Fas、Caspase-9 呈強陽性。Fas 陽性細(xì)胞在灰質(zhì)中均勻分布，在白質(zhì)中極少出現(xiàn)。Caspase-9 陽性細(xì)胞主要分布在脊髓前角，白質(zhì)中也有出現(xiàn)，低濃度、中濃度、高濃度組較模型組染色程度隨濃度的增加而降低（圖4、圖5）。

平均光密度計算結(jié)果如表1所示。

圖4 脊髓免疫組化染色（Fas），×400Fig.4 Immunohistochemistry(IHC)of spinal cord(Fas),×400

圖5 脊髓免疫組化染色（Caspase-9），×400Fig.5 IHC of spinal cord(Caspase-9),×400

表1 免疫組化平均光密度Table 1 Average optical density of IHC

2.2 討論

放射性脊髓損傷是放射治療中不可逆的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前對于此種損傷并沒有統(tǒng)一有效的解決方案。放療射線會使機體產(chǎn)生活性氧，其在放射性細(xì)胞損傷中扮演重要的角色：破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性，引起細(xì)胞損傷［4，10-11］，還可攻擊細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。

有研究表明，放射性脊髓損傷主要有3 種機制［13］：（1）射線輻照直接導(dǎo)致脊髓損傷；（2）射線輻照損傷脊髓內(nèi)動脈血管，引起缺血性改變，致使脊髓缺血性壞死，損傷靜脈血管導(dǎo)致局部毛細(xì)血管充血、出血、壞死等，引起繼發(fā)性改變；（3）機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。放射性脊髓損傷的組織學(xué)改變主要有4種：（1）出血型，脊髓內(nèi)小血管充血出血；（2）壞死型，主要見于白質(zhì)，個別神經(jīng)細(xì)胞也可見；（3）萎縮型，主要見于實質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞可見固縮或缺血性改變；（4）空泡型，白質(zhì)可見空泡樣改變。據(jù)楊永利等［14］報道，在急性脊髓損傷后，脊髓繼發(fā)性損傷對組織的損傷要大于原發(fā)急性損傷，而細(xì)胞凋亡則是繼發(fā)性脊髓損傷中導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要原因。據(jù)此猜測，在脊髓受到射線輻照之后，也會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡等繼發(fā)性脊髓損傷。細(xì)胞凋亡主要有外在和內(nèi)在兩條通路［15］，兩條通路最終都是通過激活Caspases 來使細(xì)胞凋亡［16-18］。Caspases是一個酶家族，通過級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用［19-21］。其中，外在通路是有死亡受體介導(dǎo)，F(xiàn)as 是主要的死亡受體之一。在外界信號刺激下，F(xiàn)as 與Fas-L 結(jié)合經(jīng)過一系列反應(yīng)，與Caspase-8 前體結(jié)合，組成誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合體，在經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡［22-24］。內(nèi)在途徑也被稱為線粒體途徑，外界的凋亡刺激因子與凋亡蛋白酶激活因子-1 形成多聚復(fù)合物，然后與胞漿中的Caspase-9 前體結(jié)合，引起Caspase-9 前體活化，活化后的Caspase-9 再激活下游的Caspase-3，通過級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［25］。

本實驗中，HE 染色結(jié)果顯示模型組神經(jīng)元細(xì)胞胞體固縮，嚴(yán)重者細(xì)胞核可溶解消失，少見衛(wèi)星現(xiàn)象，偶見噬神經(jīng)現(xiàn)象，還可見毛細(xì)血管擴張充血；白質(zhì)中神經(jīng)纖維腫脹，結(jié)締組織疏松，原有組織結(jié)構(gòu)被破壞。尼氏染色結(jié)果顯示模型組中尼氏體大量減少，與文獻(xiàn)［13］報道基本一致。復(fù)方樹莓籽粉溶液處理組損傷較模型組明顯減輕，且濃度越高，效果越明顯。復(fù)方樹莓籽粉中的有效成分有維生素C、維生素E，具有強抗氧化能力，這可能是其具有抗組織損傷作用的原因。免疫組化結(jié)果顯示，模型組Fas、Caspase-9表達(dá)量較空白組均明顯升高，表明射線輻照啟動了細(xì)胞凋亡通路。低濃度組、中濃度組、高濃度組表達(dá)量較模型組均有所下降。通過計算平均光密度可見濃度越高表達(dá)量越少。推測復(fù)方樹莓籽粉能夠抑制Fas、Caspase-9 的過表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，但其抑制過表達(dá)的具體機制還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在本實驗中，復(fù)方樹莓籽粉對小鼠放射性脊髓損傷具有一定的保護(hù)作用，且濃度越高，效果越明顯。該藥物能夠保護(hù)脊髓組織，并且抑制Fas、Caspase-9的過表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，但具體機制還有待進(jìn)一步實驗研究。另外，復(fù)方樹莓籽粉是否對其他組織器官的放射性損傷也有保護(hù)作用，也有待進(jìn)一步驗證。