基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的肥胖用藥規(guī)律及潛在作用分析

呂任堯，鄭曙琴

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032）

肥胖指體內(nèi)脂肪過多積累和（或）分布異常，常伴體質(zhì)量增加，是由多種因素互相作用所引起的慢性代謝性疾病[1]。中醫(yī)學(xué)中，本病最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，屬中醫(yī)“肥滿”“膏人”“脂人”“肥人”等范疇，常伴有頭暈乏力、神疲懶言、少動氣短等癥狀。研究顯示[2]，在過去30 a 中，全球肥胖率急劇增加，成年肥胖患者約有5 億之多，全世界兒童和青少年患病率也在逐漸增加。此外長期肥胖還可增加中風(fēng)、高血壓、肝膽疾病、2 型糖尿病、冠心病、腦血管病、及某些腫瘤等相關(guān)疾病的風(fēng)險，嚴重影響人類的生活質(zhì)量與身體健康[3]。因此，對于肥胖的研究與治療具有非常重要的臨床意義。然而目前肥胖的西醫(yī)治療仍充滿波折，如肥胖藥物治療的最緊迫的未解答的問題是它們在長期內(nèi)的表現(xiàn)如何，加之西醫(yī)減肥藥物缺乏大眾的廣泛接受，人們對于西醫(yī)減肥藥物安全性的擔憂仍普遍存在[4]。相比于西藥治療肥胖的種種困難，中醫(yī)在整體觀念的指導(dǎo)下，運用陰陽、五行、臟象、經(jīng)絡(luò)等學(xué)說對肥胖患者進行辨證論治的個體化治療，為臨床治療肥胖做出了重要的貢獻。今為求更加系統(tǒng)，更加直接的總結(jié)中醫(yī)藥對于肥胖治療的用藥規(guī)律以及高頻的藥物作用機制，本文通過數(shù)據(jù)挖掘的方式對中藥治療肥胖用藥規(guī)律進行總結(jié)，并對高頻藥物進行進行KEGG 通路分析，通過網(wǎng)絡(luò)分析篩選出關(guān)鍵靶點，探索其發(fā)揮藥效的可能機制，為臨床中藥治療肥胖提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及檢索方式 以計算機與人工相結(jié)合的方式進行檢索，應(yīng)用計算機以“中醫(yī)藥”或“中藥”或“中醫(yī)”與“肥胖”“肥滿”“脂人”“肥人”“膏人”“單純性肥胖”“肥胖癥”等關(guān)鍵詞與自由詞相組合檢索中國知識資源總庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫（CBMdisc）、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫（VIP）關(guān)于中醫(yī)藥治療肥胖的相關(guān)文獻，檢索時間：1999 年1 月—2018 年12 月。將檢索到的文獻逐篇下載，以人工篩查的方式收錄其中符合本文排除與納入標準的期刊文獻共143 篇及其中符合排除與納入標準的中藥組方148 首。

1.2 納入標準 1）文獻第一診斷均為單純性肥胖。2）文獻中所使用的中藥組方具有明確的藥物組成。3）文獻中認定此組方服之結(jié)局良好。4）收錄組方均為中醫(yī)內(nèi)服湯藥。5）多篇文獻中同一組方只納入1 篇，藥物組成僅選取主方（基本方）。

1.3 排除標準 1）非單純中藥治療文獻。2）動物實驗、文獻綜述、文獻評價、Meta 分析等非臨床試驗。3）同一數(shù)據(jù)在不同期刊中重復(fù)報道的文獻。4）治療結(jié)局不明確文獻。5）組方藥物不完整文獻。

1.4 數(shù)據(jù)標準化與錄入

1.4.1 數(shù)據(jù)標準化 參照人民衛(wèi)生出版社第3 版《中藥學(xué)》及2015 版《中華人民共和國藥典》對組方中的中藥名稱進行規(guī)范，如“仙靈脾”統(tǒng)一規(guī)范為“淫羊藿”；“生地黃”統(tǒng)一規(guī)范為“地黃”。

1.4.2 數(shù)據(jù)錄入 根據(jù)納入與排除標準對收錄文獻進行嚴格篩選，提取符合標準中藥組方的藥物信息，錄入Microsoft Excel 2016 軟件，以無序分類變量二項分類的方式，雙人錄入，橫坐標為藥物名稱，縱坐標為組方ID，將單個組方中出現(xiàn)的藥物在相應(yīng)單元格記為“1”，否則記為“0”，建立“中藥治療肥胖數(shù)據(jù)庫”。

1.5 統(tǒng)計方法 利用Excel 2016 對整理的方劑進行數(shù)據(jù)錄入。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析采用Apriori 算法，最低支持度設(shè)為0.1，最低置信度設(shè)為0.8，分別取支持度、置信度、提升度排序前6 的規(guī)則進行整理。聚類分析采用K-means 和層次聚類的方法，其中聚類數(shù)目通過Gap 統(tǒng)計量確定，距離度量采用歐式距離。主成分分析通過變量的協(xié)方差矩陣找出方差最大化的新線性組合，作為原始變量的主成分以最大限度解釋原始變量，分別取貢獻度最大的前20 個主成分作為用藥的主要規(guī)律進行分析。本研究所有數(shù)據(jù)挖掘分析基于R3.5.2。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 使用BATMAN-TCM 系統(tǒng)預(yù)測高頻藥物所含化學(xué)成分，并獲取對應(yīng)靶點；把這些靶點與Genecard 數(shù)據(jù)庫中檢索到的肥胖相關(guān)靶點相映射并取交集，將其作為治療肥胖的潛在作用靶點；將上述靶點導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，對其進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選出高頻藥物治療肥胖病的核心靶點，并上傳至DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索、文獻驗證，獲取高頻藥物治療肥胖病的重要通路。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次統(tǒng)計 在錄入的148 個中藥組方中，共涉及中藥172 味。結(jié)果顯示，使用頻率≥10%的藥物共21 種，依次為茯苓（56.75%），澤瀉（50%），白術(shù)（43.93%），山楂（39.86%），半夏（27.03%），大黃（27.03%），決明子（26.35%），甘草（25.68%），荷葉（25%），陳皮（24.32%），蒼術(shù)（23.65%），黃芪（21.62%），枳實（16.89%），丹參（16.89%），厚樸（14.86%），薏苡仁（13.51%），山藥（12.84%），柴胡（12.16%），黨參（11.49%），桂枝（10.81%），防己（10.81%）。見圖1。

圖1 中藥治療肥胖主要藥物統(tǒng)計

2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，以支持度由高到低排序的藥對依次為白術(shù)與茯苓，半夏與茯苓，陳皮與茯苓，蒼術(shù)與茯苓，澤瀉、白術(shù)與茯苓，山楂、白術(shù)與茯苓，見表1。以置信度由高到低排序的藥對依次為甘草、半夏與茯苓，半夏、白術(shù)與茯苓，半夏、陳皮與茯苓，半夏、澤瀉與茯苓，蒼術(shù)、白術(shù)與茯苓，陳皮、白術(shù)與茯苓，見表2。以提升度由高到低序的藥對依次為陳皮、茯苓與半夏，澤瀉、丹參與山楂，丹參與山楂，茯苓、澤瀉、丹參與白術(shù)，甘草、半夏與茯苓，半夏、白術(shù)與茯苓，見表3。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析網(wǎng)絡(luò)化展示見圖2。

表1 中藥治療肥胖的藥物關(guān)聯(lián)度分析（支持度）

2.3 聚類分析 采用K-means 和層次聚類的方法，其中聚類數(shù)目通過Gap 統(tǒng)計量確定，距離度量采用歐式距離。對所有藥物進行聚類分析，兩種聚類方法得出結(jié)果幾乎一致，結(jié)果見圖3。其中以層次聚類的方法對藥物進行聚類，形成2 個聚類藥物群：第1 組包含的藥物有：澤瀉、茯苓、白術(shù)、山楂、荷葉、丹參、半夏、陳皮、蒼術(shù)、厚樸、薏苡仁、黃芪、甘草。第2 組藥物較為繁雜，其又分為兩組，其中有代表性的一組主要包含的藥物有：大黃、枳實、柴胡、白芍、生姜、大棗、黃芩、黃連。

表2 中藥治療肥胖的藥物關(guān)聯(lián)度分析（置信度）

表3 中藥治療肥胖的藥物關(guān)聯(lián)度分析（提升度）

圖2 中藥治療肥胖關(guān)聯(lián)規(guī)則分析網(wǎng)絡(luò)化展示

圖3 中藥治療肥胖聚類分析結(jié)果展示圖

2.4 主成分分析 前4 個維度主成分貢獻圖如圖4，分別取主成分中高于評價貢獻的中藥變量作為此維度的代表用藥，其中維度1 方差貢獻率為8.5%，主要包含的藥物有：茯苓、白術(shù)、大黃、蒼術(shù)、半夏、澤瀉、等維度2 方差貢獻率為7%，主要包含的藥物有：山楂、決明子、荷葉、澤瀉、丹參等，維度3 方差貢獻率為5.2%，主要包含的藥物有：半夏、陳皮、黃芪、山楂、枳實、防己、厚樸等，維度4 方差貢獻率為4.5%，主要包含的藥物有：白術(shù)、澤瀉、甘草、蒼術(shù)、山楂、丹參、決明子等。前4 個維度中藥和方劑間關(guān)系的雙標圖見圖5。

2.5 基于BATMAN-TCM 分析高頻藥物茯苓治療肥胖的潛在作用機制

2.5.1 高頻藥物茯苓靶點預(yù)測 在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中以“Fu Ling”為關(guān)鍵詞，“Score cutoff”設(shè)置為30，“Adjusted P-value”設(shè)置為0.05，檢索出茯苓中所含化合物17 種，包括Choline、Dehydroeburicoicacid、Ergosterol、Pachymic Acid、Beta -Amyrin Acetate、P -Hydroxybenzyl Alcohol 等，同時獲取這些化合物對應(yīng)靶點230 個。

2.5.2 肥胖相關(guān)靶點檢索 以“obesity”為關(guān)鍵詞，在Genecard 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）中檢索obesity 相關(guān)靶點，與BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點相映射并取交集，共獲得茯苓治療治療肥胖病的靶點90 個。

圖4 中藥治療肥胖主成分分析前4 個維度主成分貢獻圖

圖5 中藥治療肥胖主成分分析前4 個維度中藥和方劑間關(guān)系的雙標圖

2.5.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述獲得的90 個潛在作用靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為人，設(shè)定最高置信度0.9，獲得蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，結(jié)果存儲為TSV 格式，保留文件中node 1 和node 2 信息并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，對其進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中連接度Degree 排名前10的靶點，作為茯苓治療肥胖病的核心靶點。見圖6，其中節(jié)點的大小表示Degree 值的大小，節(jié)點大小越大，代表Degree 值越大。邊的粗細表示Combine score，邊越粗Combine score 值越大。

2.5.4 KEGG 通路分析 將獲得的靶點上傳至DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫中，保留P＜0.05 的通路，將這些通路與CTD 數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）中obesity 相關(guān)通路進行匹配，并檢索文獻進行驗證，選取與肥胖病關(guān)系最密切的通路作為茯苓治療肥胖病的重要通路。KEGG通路分析結(jié)果得到32 條信號通路，其中與肥胖病關(guān)系密切的通路20 條。見表4。

3 討論

圖6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）圖

表4 KEGG 代謝通路

歷代醫(yī)籍很早就對肥胖這一病癥的病因病機及治療進行了詳細的論述?！端貑枴ねㄔu虛實論》曰：“肥貴人，則膏粱之疾也?！睂⒁鸱逝值闹饕驓w之于飲食不節(jié)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》不單從病因方面對肥胖進行了討論，并且對肥胖的病位給與了明確的論述，指出肝、脾、腎三臟與肥胖的發(fā)生息息相關(guān)[5]。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，眾多名家都對肥胖的病機提出詳細而深入的理論創(chuàng)新。包括元·朱震亨在《丹溪心法》《格致余論》，清代喻昌在《醫(yī)門法律》以及張聿青在《張聿青醫(yī)案》中對于肥胖的論述，3 位醫(yī)家均認為“肥人多痰多濕”，將肥胖的關(guān)鍵病機歸之于痰濕，總結(jié)了對于肥胖病人應(yīng)以健脾利濕化痰為治療大法[6]。誠如清·陳世鐸于《石室秘錄》中所言：“肥人多痰，乃氣虛也。虛則氣不能運行，故痰生之”，并且進一步論述了治療肥胖需補脾胃之氣，并補命門之火，指出氣虛乃肥胖之病機，氣足則痰自消矣。清·王清任所著的《醫(yī)林改錯》中載：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而淤”，闡明氣虛血瘀亦為肥胖之重要病機。國醫(yī)大師王琦[7]在前人經(jīng)驗指導(dǎo)下結(jié)合臨床實踐，強調(diào)肥胖應(yīng)從“氣虛”“痰濕”“血瘀”3 個方面綜合調(diào)治，為中藥治療肥胖提供了堅實的理論依據(jù)。

通過對中醫(yī)藥治療肥胖組方的用藥頻次分析發(fā)現(xiàn)，使用頻率較高的藥物有茯苓、澤瀉、白術(shù)、山楂、半夏、大黃、決明子、甘草、荷葉、陳皮、蒼術(shù)、黃芪、枳實、丹參、厚樸、薏苡仁等。以上藥物中茯苓、白術(shù)、陳皮、蒼術(shù)、黃芪、薏苡仁，均為燥濕健脾之常用藥。半夏、陳皮、厚樸均為燥濕化痰之要藥。澤瀉利水滲濕、泄熱、化濁降脂，甘草既可燥濕又可化痰，枳實兼具消積與化痰之功效?，F(xiàn)在研究證明[8-12]，具有化瘀消脂作用的山楂、大黃、決明子、荷葉、丹參對于肥胖的治療效果較為顯著。研究結(jié)果可見，健脾利濕化痰為中藥治療肥胖主要治則，這與中醫(yī)學(xué)對于“肥人多痰濕”“肥人多氣虛”的理論相呼應(yīng)。

關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，白術(shù)與茯苓，半夏與茯苓的支持度最高，分別為0.35 和0.23，反映了這兩對藥物在治療肥胖的組方中出現(xiàn)的概率最大。顯示這兩藥對在臨床治療肥胖中最為常用。其中白術(shù)與茯苓配伍，白術(shù)健脾益氣，燥濕利水，茯苓利水滲濕健脾，兩者共奏健脾化濕之功。半夏燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)，與茯苓相配伍，茯苓長于健脾滲濕，半夏長于燥濕化痰，兩藥合用標本兼治，顯示兩藥對在臨床的治療肥胖中最為常用。按置信度的排序，甘草、半夏與茯苓，半夏、白術(shù)與茯苓為最高，均為1。從置信度反映的前項后項藥物同時出現(xiàn)的次數(shù)占前項藥物出現(xiàn)次數(shù)的比例來看，臨床上中藥治療肥胖，甘草、半夏與半夏、白術(shù)兩組藥對常與茯苓同時使用。以提升度來分析，陳皮、茯苓與半夏的正相關(guān)性為最高（提升度為3），說明半夏在應(yīng)用陳皮、茯苓這對藥物治療肥胖的組方中的使用頻率提升2 倍。不難發(fā)現(xiàn)上述3 組結(jié)果同樣體現(xiàn)了燥濕健脾化痰這一治則在治療肥胖過程中的重要性，因痰由濕生，濕責之于脾，從而理氣健脾以袪痰，標本兼邪而不傷正。提示臨床中治療肥胖多以具有益氣健脾，燥濕化痰功效的藥物互相配伍使用。

基于以層次聚類的方法對藥物進行聚類，結(jié)果顯示，第1 組以健脾滲濕藥和燥濕化痰藥加之具有祛瘀消脂作用的山楂、丹參、荷葉為主。從病機角度對肥胖進行探究，本病的病機往往相互影響相互轉(zhuǎn)化，脾虛日久，脾不升清，運化失司，水谷精微失于輸布，則易聚濕生痰，故而肥胖。脾氣虧虛，氣虛推動無力，血行不暢而瘀滯，氣不為用則氣郁，或痰濕內(nèi)停，阻礙氣血運行均可致氣滯血瘀，進而發(fā)為肥胖。以第1 組藥物之功效進行總結(jié)分析，益氣健脾，燥濕化痰，祛瘀消脂為肥胖的常用治法，為大多數(shù)肥胖患者治療所共用。第2 組藥物由于個體差異的不同，藥物加減亦不同，藥物較為繁雜，故選取較為有代表性的一組進行討論，選出的藥物組為大柴胡湯的基礎(chǔ)組方。仝小林教授[13]古方今用，應(yīng)用大柴胡湯治療肥胖取得了顯著療效，佐證了以大柴胡湯為基礎(chǔ)方，運用消膏降濁、消積導(dǎo)滯、化痰通腑之法，對于治療肥胖的肯定意義，對臨床治療肥胖用藥具有一定的參考作用。采用K-means 聚類的方法與以層次聚類的方法對藥物進行聚類的結(jié)果幾乎相同，在此不再贅述。

主成分分析中，從雙標圖分析得到，茯苓、白術(shù)、澤瀉、山楂、半夏、陳皮、荷葉、決明子、蒼術(shù)、大黃、丹參、黃芪等藥物在中藥治療肥胖的組方用藥中更為重要。由主成分貢獻圖中分析得到，維度1 包含的藥物以健脾利水為主要功效。維度2 包含藥物中山楂、荷葉、澤瀉、丹參均有化瘀的功效。維度3 包含的藥物以化痰為主要共性。維度4 包含的藥物中白術(shù)、甘草、蒼術(shù)均可益氣健脾，澤瀉、山楂、丹參，均可化瘀。有研究結(jié)果表明[14]，肥胖主要病機為痰濕、血瘀、氣虛等證。上述結(jié)果亦與國醫(yī)大師王琦提出的肥胖應(yīng)從“氣虛”“痰濕”“血瘀”3 個方面綜合調(diào)治這一理論相符合。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析高頻藥物茯苓治療肥胖的潛在作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯苓治療肥胖涉及多通路、多靶點。其中篩選出的靶點排名較高的有ANXA1，HTR1A，CXCR4，ADRA2B，CNR1，ADRA2A，HTR1B，PTGER3，DRD2 等，提示這些靶點可能是茯苓發(fā)揮治療肥胖作用的核心靶點。如AnxA1 水平與BMI，腰圍和腰臀比呈正相關(guān)，與急性期蛋白，C-反應(yīng)蛋白（CRP）和脂肪細胞因子瘦素的血漿濃度呈負相關(guān)，且通過實驗得出ANXA1 是小鼠肥胖的重要調(diào)節(jié)因子，可能是通過調(diào)節(jié)脂解和（或）糖皮質(zhì)激素水平這一機制來進行[15-16]。DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進行通過KEGG 通路分析結(jié)果得到32 條信號通路，其中與肥胖病關(guān)系密切的通路20 條，涉及5-羥色胺能突觸、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、脂肪細胞因子信號通路、胰島素抵抗、胰島素信號通路等。如中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺通過交感神經(jīng)/副交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)食欲并控制代謝器官，外周神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺以自分泌/旁分泌或內(nèi)分泌方式調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，胰島素抗性和能量消耗來調(diào)節(jié)肥胖[17]。大量證據(jù)表明[18]，脂肪細胞因子在健康受試者的代謝穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，而這些因素的缺陷，由肥胖和脂肪細胞功能障礙引起，是肥胖周圍疾病群發(fā)病機制中的一個核心組成部分。如代謝調(diào)節(jié)中最有效的脂肪細胞因子之一的瘦素通過向其他器官，尤其是下丘腦，發(fā)送營養(yǎng)狀況信號，經(jīng)下丘腦產(chǎn)生調(diào)節(jié)食物攝入和能量消耗的神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)來調(diào)節(jié)體質(zhì)量[19]。上述結(jié)果均表明茯苓對治療肥胖具有潛在的研究價值，為進一步深入研究其作用機制提供參考與方向。

綜上所述，本研究采用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對中藥治療肥胖的用藥規(guī)律及高頻藥物茯苓治療肥胖的潛在作用機制進行了多角度的探析，為臨床中藥治療肥胖提供了可靠的用藥參考，也為更深一步的探究中藥治療肥胖的作用機制提供了新的方向與數(shù)據(jù)支撐。由于數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)庫之間內(nèi)在的復(fù)雜性與信息的不完善以及化合物之間的相互作用的不確定性，故研究預(yù)測的結(jié)果具有一定的局限性，需要構(gòu)建復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行進一步的深入挖掘及驗證。