探討植物單染色體測序中的假陽性問題

王發(fā)明 莫權輝 葉開玉 龔弘娟 劉平平 蔣橋生 齊貝貝 李潔維

摘 要：單細胞測序技術目前雖已廣泛應用于人類、動物、微生物等物種的研究，但由于細胞壁的存在，使得該技術在植物上的應用舉步維艱。如果能先分離出植物單條染色體，然后再應用單細胞測序技術進行擴增和測序，則可以避免細胞壁的干擾，從而具有重要的應用價值。雖然科研人員一直嘗試針對單條植物染色體進行測序，但目前尚未見有成功的報道，也未見有文章對失敗的原因進行討論。該研究以六倍體中國春小麥為材料，針對使用單細胞測序技術進行單染色體擴增過程中出現(xiàn)的假陽性問題進行了探討，分析了單染色體擴增失敗的主要原因，并通過高通量測序技術研究了外源污染的可能來源。結(jié)果表明：在對實驗器具、耗材、環(huán)境污染嚴格防控的基礎上，人體接觸可能是造成污染的主要來源;同時，推測單染色體之所以擴增失敗可能是因為染色體自身超螺旋狀態(tài)造成引物難以結(jié)合和復制。該研究還針對存在的問題提出了可行性建議，為將來成功進行單染色體測序提供了有益的借鑒。

關鍵詞：單染色體，單細胞測序，外源污染，假陽性，MDA，MALBAC

中圖分類號：Q943文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）01-0016-08

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract：Single-cell sequencing technology is widely used in the research of human，animal，microorganism and other species，but it is hard to be applied in plant because of being cell wall. If a single chromosomes can be separated from plant cells and then were used for amplification and sequencing with single-cell sequencing technique，the barrier of plant cell wall will be removed and be of important application value. However，there are to date no claims on the successful application of single chromosome sequencing，and the causes of the failure are poorly understood. The issue of false positives that commonly exist in single chromosome amplification was studied，and the main causes of the failure in single-chromosome amplification were discussed. Besides，the probable sources of exogenous pollution in chromosome amplification were studied with high-throughput sequencing，and human body was proved to be the most probable sources of pollution on the basis of all experimental tools，materials，reagents and spaces being under extremely sterilized treatments. The super helical structures of chromosomes themselves were considered as the primary cause of failure in amplification，as primers were hard to bind to strands of DNA to start replication. Finally，some feasible suggestions were put forward. This study provides beneficial lessons for the successful single-chromosome sequencing in the future.

Key words：single chromosome，single-cell sequencing，exogenous pollution，false positives，multiple displacement amplication （MDA），multiple annealing and looping-based amplication cycles （MALBAC）

單細胞測序技術，是目前生命科學研究的熱點技術之一。單細胞測序技術可以在單個細胞水平上，使用極微量模板對基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等進行高通量測序分析，可以獲得用常規(guī)組織樣本無法獲得的單個細胞的異質(zhì)性信息，從而被廣泛應用于人類的疾病診斷、癌癥的早期檢測以及發(fā)育生物學、微生物學和神經(jīng)生物學等方面（Lasken，2007; Navin et al.，2011; Huang et al.，2015）。目前，單細胞全基因組測序普遍使用的技術，包括多重置換擴增技術（multiple displacement amplification，MDA）（Hosono et al.，2003）和基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴增技術（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）（Zong et al.，2012）。單細胞測序技術目前已廣泛應用于人類、動物和微生物等方面的研究，但在植物上的研究應用較少，主要原因是植物存在細胞壁，使用普通方法難以進行分離和裂解。嚴建兵團隊曾發(fā)現(xiàn)了一種簡單可行的方法，成功分離出玉米小孢子四分體，并使用單細胞測序技術成功進行了全基因組測序，獲得了多個創(chuàng)新性的科學發(fā)現(xiàn)（Li et al.，2015）。這是單細胞測序技術在植物上的首次成功應用。然而，單細胞測序技術在染色體水平上的應用卻尚未見有成功的報道。

植物染色體是植物細胞在有絲分裂或減數(shù)分裂時的超螺旋存在形式，是染色質(zhì)的高級結(jié)構，容易分辨和分離。那么，能否利用單細胞測序技術來進行單條植物染色體的體外擴增和測序呢。單細胞測序技術可以對單個微生物細胞進行測序，多數(shù)細菌基因組大小不足十兆，遠低于很多植物單條染色體的大小，因此利用單細胞測序技術進行植物單染色體測序從理論上是可行的。通過分離染色體進行體外擴增，可以避免細胞壁的干擾，目前雖然已有較多分離單條染色體并進行體外擴增的成功案例，但使用的主要是基于PCR的全基因組擴增技術，如簡并寡核苷酸引物擴增技術（DOP-PCR）（Telenius et al.，1992）和接頭介導的PCR擴增技術（LA-PCR）（Chen & Armstrong，1995）。這些技術存在非特異性擴增、擴增偏倚和擴增結(jié)果基因組覆蓋度低等問題。如果能使用單細胞測序技術進行植物單條染色體的擴增，則可以從根本上解決這些問題，具有可預期的廣闊應用前景。但是，目前關于這方面研究的報道較少。殷卉等（2015）在巴西橡膠樹上嘗試應用單細胞測序技術對橡膠樹單條染色體進行體外擴增，但一直未見后續(xù)的研究報道。

植物單條染色體的體外擴增除了對極微量模板的考驗以外，外源污染的防控還是該技術應用的重要環(huán)節(jié)，如何有效防控外源污染是微量模板能否正確擴增和保證后續(xù)測序質(zhì)量的關鍵因素。但是，基于MDA、MALBAC技術的擴增敏感性，即使有極微量外源核苷酸模板的存在也可能造成污染的擴增和放大，從而造成假陽性現(xiàn)象并導致擴增失敗。擴增過程中外源污染可能來源于實驗環(huán)境，也可能來自實驗試劑、水、各種緩沖液，擴增使用的槍頭、離心管等耗材器具以及染色體制備和分離過程中使用的玻片、玻璃針等（王發(fā)明等，2010）。此外，實驗室環(huán)境下的氣溶膠污染也不容忽視（杜茜等，2015）。因此，只有在植物單染色體體外擴增的各個環(huán)節(jié)都應該對外源污染進行嚴格防控，才能保證擴增的高質(zhì)量。

目前，單染色體測序還未見有成功的報道，筆者在同測序公司和其他單位相關領域人員交流時，發(fā)現(xiàn)普遍存在假陽性現(xiàn)象嚴重而目標染色體卻沒有得到有效擴增的問題。針對這種問題，尚未見有人進行過系統(tǒng)研究和提出可行性建議，特別是對假陽性現(xiàn)象形成的原因和污染的主要來源還認識不足，這樣不利于有針對性地提出外源污染防控策略和改進實驗方案。

本研究嘗試使用單細胞測序的方式對小麥單條染色體分離后進行體外擴增和測序，在嚴格防控外源污染的前提下，針對實驗過程中普遍遇到的假陽性問題進行研究，旨在探討其可能來源和形成原因，并針對單染色體測序存在的主要問題提出可行性建議，以期為植物單染色體測序的開展提供經(jīng)驗和參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

六倍體中國春小麥（2n=6×=42）種子，由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所王道文課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 小麥中期染色體制備和單條染色體分離 將六倍體中國春小麥種子用冷水于4 ℃冰箱浸泡1 d后，置于25 ℃下避光培養(yǎng)，當其根尖長至1.5～2.0 cm時，用鋒利的刀片將其切下，用0.1%秋水仙素預處理3 h，無菌水洗凈后用卡諾固定液（冰醋酸∶純酒精=1∶3）于低溫下固定5 min，轉(zhuǎn)入70%酒精中，4 ℃冰箱保存。使用時用鑷子取出所需數(shù)量的根尖，用無菌水沖洗3遍，控干水分。分別加入體積比4%和3%的纖維素和果膠酶20 μL，37 ℃ 酶解45 min，酶解完成后，用無菌水沖洗3遍，控干水分，滴加10 μL卡寶品紅染液，用槍頭將根尖搗碎，略放置后進行壓片。先將壓片完成后的玻片置于-70 ℃超低溫冰箱中放置30 min，再迅速揭掉蓋玻片，置于倒置顯微鏡下觀察和使用微細玻璃針法進行顯微分離（Nikon Ti-S研究級倒置顯微操作系統(tǒng)）。在分離單條染色體的同時，也分離包含全部中期染色體的單個完整細胞作為對照。

1.2.2 染色體MALBAC擴增 分離后的包含全部染色體的單個完整細胞和單條小麥染色體是使用億康公司的MALBAC微量基因組快速擴增試劑盒（KT110700324）來進行擴增。操作過程詳情見使用說明書（http：//www.yikongenomics.com/upload/2017/1124/KT1107003_MALBACweiliangjiyinzukuaisukuozengshijihechanpinshuomingshu_zhongwenPM-40c9e.pdf）。根據(jù)說明書分別將擴增循環(huán)數(shù)設置為適合單條染色體擴增的21個循環(huán)和常規(guī)的17個循環(huán)。擴增完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 染色體MDA擴增 分離后的包含全部染色體的單個完整細胞和單條小麥染色體是使用Qiagen公司的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）來進行擴增，操作過程詳情見使用說明書（https：//www.qiagen.com/cn/resources/resourcedetail？id=38faca1c-64b0-4281-aab3-aa8324bbd181&lang=en）。擴增完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在使用試劑盒自行體外擴增的同時，使用安諾優(yōu)達基因科技有限公司提供的解離液在分離部分單條染色體后委托其進行體外擴增。

1.2.4 污染源排除實驗 為了研究染色體擴增過程中的假陽性現(xiàn)象以及對外源污染的可能來源進行排除，我們委托億康基因公司使用MALBAC技術對實驗使用的無菌水、PBS溶液、離心管和試劑盒本身進行了檢測。實驗設計如表1所示。

1.2.5 SCoT分子標記檢測 由于SCoT分子標記是一種目標起始密碼子多態(tài)性標記，因此可以用來檢測外源污染物是來自其他外源物種基因還是因引物多聚體形成的。SCoT引物是根據(jù)Collard & Mackill （2009）和Luo et al.（2011）公布的引物序列來合成。本研究用于單染色體擴增產(chǎn)物的PCR檢測的SCoT引物如表2所示。

使用20 μL反應體系：2×Taq PCR Mix 10 μL、擴增產(chǎn)物（稀釋1 000倍，約30 ng·μL-1） 1.0 μL、10 μmol·L-1引物0.8 μL、超純水8.2 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。取8 μL擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖電泳檢測。

1.2.6 Southern雜交鑒定 將小麥全基因組DNA酶切產(chǎn)物與染色體擴增產(chǎn)物及陰性對照一起進行電泳，并通過印記雜交的方式轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybond尼龍膜上，小麥全基因組DNA經(jīng)酶切、標記后作為探針進行雜交。具體操作步驟參照羅氏公司生產(chǎn)的“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter-KitⅠ（Roche）”試劑盒說明書進行。

1.2.7 高通量測序 選擇小麥染色體假陽性擴增產(chǎn)物，構建單細胞基因組MDA類型文庫，文庫質(zhì)檢合格后，使用Illumina測序平臺進行高通量測序，測序讀長PE150。對過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)隨機抽取10 000條Reads數(shù)據(jù)，通過Blast軟件比對NT庫，分析可能的污染源。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥中期染色體制備和顯微分離

在40倍鏡下，尋找到分散良好、視野清晰的小麥中期染色體分裂相，制備微細玻璃針，使用顯微操作儀準確挑出單條小麥染色體（圖1）。染色體通過靜電作用吸附在針尖上，迅速轉(zhuǎn)移至放有裂解液的200 μL離心管中，8 000 r·min-1簡短離心20 s，進行后續(xù)擴增實驗。

2.2 MALBAC和MDA方法對小麥染色體進行擴增出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象

分別使用基于MALBAC技術的MALBAC微量基因組快速擴增試劑盒（KT110700324）和基于MDA技術的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）進行擴增的結(jié)果顯示（圖2），包含全部染色體的完整細胞的擴增條帶（1號泳道）跟單個染色體的擴增條帶（2號泳道）帶型基本一致。但是，兩種方法中無菌水陰性對照（3號泳道）和PBS陰性對照（4號泳道）也分別擴增出了與目標樣品明顯類似的條帶。兩種使用單細胞測序試劑盒進行擴增的方法均出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，說明擴增過程中可能存在外源DNA污染。

2.3 可能污染源的排除

為了排除假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因，我們委托億康基因公司使用MALBAC單細胞擴增試劑盒，針對擴增過程中使用的無菌水、PBS溶液、離心管以及試劑盒本身分別進行了排除。研究結(jié)果表明，體外擴增使用的水及各種試劑、耗材均未檢測到明顯擴增，沒有擴增條帶出現(xiàn)（圖3：A），而陽性對照卻擴增出了明顯條帶（圖3：B），說明污染在可控范圍之內(nèi)。經(jīng)咨詢公司得知，其檢測時在第二輪擴增使用的是17個循環(huán)，不是本實驗進行單染色體擴增使用的21個循環(huán)。當我們改為17個循環(huán)進行擴增時，染色體及陰性對照均沒有擴增出條帶。這說明在較高的循環(huán)數(shù)下，BALBAC單細胞技術容易產(chǎn)生非特異性假陽性擴增。

2.4 使用SCoT分子標記對擴增結(jié)果進行初步驗證

既然試劑耗材沒有產(chǎn)生明顯的外源污染，那么為什么使用MALBAC技術擴增時增加循環(huán)數(shù)或者使用MDA技術擴增時卻均出現(xiàn)了較明顯的假A. 使用MALBAC技術對分離的染色體進行擴增（循環(huán)數(shù)21）; B. 使用MDA技術對分離的染色體進行擴增。1. 一個完整細胞的全部染色體; 2. 單條染色體; 3. 無菌水陰性對照; 4. PBS陰性對照; M. DNA Marker-Q，分子量大小分別為200、400、600、800、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000、10 000 （bp）。

A. Amplification with MALBAC technique （21 cycles）; B. Amplification with MDA technique. 1. Whole chromosomes of a single wheat cell; 2. A single chromosome of wheat; 3. Negative control （sterile water）; 4. Negative control （PBS solution）; M. DNA Marker-Q，molecule weight are 200，400，600，800，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，4 000，5 000，6 000，8 000，10 000 （bp），respectively.

陽性現(xiàn)象呢？其可能形成的原因是什么？為此，我們使用SCoT分子標記來檢測外源污染是來自其他外源物種基因還是由于引物多聚體形成。擴增結(jié)果顯示（圖4），陰性對照和MALBAC技術擴增的樣品均沒有明顯的多態(tài)性條帶出現(xiàn)，而使用MDA技術擴增的樣品使用引物P17和引物P21時，包含全部染色體的單個細胞（3號）和單條染色體（5號）卻有兩個樣品出現(xiàn)了較明顯的擴增條帶，說明這兩個樣品可能是真實外源基因的擴增。

2.5 使用Southern印跡對擴增結(jié)果進行驗證

為了進一步驗證上述3號和5號樣品是否為小麥染色體的真實擴增還是外源物種基因的擴增，我們對其進行了Southern雜交驗證，使用小麥基因組DNA標記的探針對這兩個樣品的MDA擴增產(chǎn)物進行雜交，結(jié)果顯示除基因組陽性對照外，這兩個樣品及陰性對照均沒有雜交信號出現(xiàn)（圖5）。因此，證明該擴增產(chǎn)物可能是外源物種DNA污染造成。

2.6 高通量測序和序列比對驗證污染類型及可能來源

為了進一步證明該污染源的可能來源及其類型，我們對3號和5號樣品的擴增產(chǎn)物進行了全基因組測序，并隨機挑選委托安諾優(yōu)達基因科技有限公司擴增的2個樣品（MDA01和MDA02）進行建庫測序。將以上4個樣品的測序結(jié)果進行比對后顯示，其均未比對到小麥基因組上，而比對到了人（Homo sapiens）、微生物（Propionibacterium acnes、Cutibacterium acnes）、黑猩猩（Pan troglodytes）等物種上（表3）。其中，Cutibacterium acnes （Propionibacterium acnes）和Propionibacterium phage兩種微生物均可以棲息在人的皮膚上（Lood & Collin，2011; Brigitte et al.，2018）。

3 討論

首先分離單條染色體，然后再進行體外擴增，A 1-6. 實驗1 中的PBS、水、空白各2次; 7-8. 實驗3中的水各2次; 9-14. 實驗2 中的PBS、水、空白各2次; 15-18. 實驗4中的水、空白各2次。 B 1702A試劑17個循環(huán)擴增效果。1. 陽性樣本（50 pg小麥基因組DNA）; 2-3. 空白對照。

A 1-6. Detection of the PBS，water，blank in Test 1，each repeated twice; 7-8. Detection of the water in Test 3，repeated twice; 9-14. Detection of the PBS，water，and blank in Test 2，each repeated twice; 15-18. Detection of the water and blank in Test 4，each repeated twice. B Detected by MALBAC technique with 17 cycles. 1. Positive sample （50 pg wheat genomic DNA）; 2-3. The blank control.

1-2. 空白對照擴增產(chǎn)物（MDA擴增產(chǎn)生的假陽性產(chǎn)物）; 3. 使用MDA技術擴增的一個細胞的全部染色體（42條）;? 4-5. 使用MDA技術擴增的單條小麥染色體; 6-7. 使用MALBAC技術擴增的單條小麥染色體。

1-2. Amplification products of blank control （false positive amplification products with MDA）; 3. Amplification products of the whole 42 chromosomes in a cell of wheat with MDA technique; 4-5. Amplification products of a single chromosome of wheat with MDA technique;? 6-7. Amplification products of a single chromosome of wheat with MALBAC technique.

建立單條染色體DNA文庫，對于構建高密度分子標記連鎖圖譜和分離重要基因、基因物理作圖和染色體進化等研究具有重要應用價值。在高通量全基因組測序中，一些物種基因組比較復雜，由于多倍體、雜合程度高或重復序列多等問題而導致后續(xù)數(shù)列的組裝和拼接困難，且質(zhì)量和效率低。如果能分離出單條染色體，針對單條染色體進行擴增和測序，則會大大降低物理圖譜構建的難度。

近些年來，雖然國內(nèi)外多家單位嘗試使用單細胞測序的技術進行單染色體測序研究，但目前還沒有成功的報道，主要原因是外源污染的假陽性擴增嚴重。本研究在嚴格防控外源污染的基礎上，針對單染色體測序過程中出現(xiàn)的假陽性問題進行研究，探討其可能的污染途徑和來源，并提出個人觀點：（一）假陽性現(xiàn)象難以完全避免。首先，單染色體的分離和體外擴增涉及較多步驟，每個步P. 陽性對照（小麥基因組酶切產(chǎn)物）; 3. 圖4中3號（一個完整小麥細胞的全部42條染色體）擴增產(chǎn)物; 5. 圖4中5號（單條小麥染色體）擴增產(chǎn)物; N. 假陽性擴增產(chǎn)物。

P. Positive control （restricted wheat genomic DNA）; 3. The same amplification products as the above sample No. 3 in Fig. 4 （the whole 42 chromosomes in a wheat cell）; 5. The same amplification products as the above sample No. 5 in Fig. 4 （a single wheat chromosome）; N. False positive amplification products.

驟涉及使用較多試劑、耗材和不同操作空間，絕對控制外源污染困難較大。其次，在使用MALBAC技術進行擴增時，在第二輪使用較多的循環(huán)數(shù)會增加假陽性現(xiàn)象發(fā)生的幾率;而使用MDA技術進行擴增時，陰性對照也往往產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象（ Marcy et al.，2007; Yilmaz et al.，2010）。兩種單細胞測序技術對模板的擴增均具有較高靈敏度，假陽性的存在可能是因為極微量外源DNA在目標樣品缺乏時被擴增或引物自身形成的引物多聚體現(xiàn)象，如果在目標樣品存在并獲得優(yōu)先擴增的情況下，外源污染的擴增或多聚物的形成則會被抑制。本研究在對假陽性產(chǎn)物進行測序分析時發(fā)現(xiàn)，污染物的來源與人體密切相關，其他來源的污染相對較少，說明對環(huán)境、試劑、耗材等的污染較易防控。但是，人體無法使用常規(guī)方式對外源DNA進行降解和破壞。因此，在實驗過程中，要嚴格避免人體任何部位與實驗試劑、耗材甚至操作環(huán)境的直接接觸，要全程穿戴一次性鞋套、口罩、帽子、實驗服等，最大限度的減少外源污染。（二）單染色體擴增失敗可能并不是因為模板量太小，而是由于染色體本身沒有得到有效擴增。本研究中，使用一個完整細胞的全部42條染色體進行擴增，同樣沒有獲得目標樣本的基因組擴增信息，而小麥基因組大小為15.4～15.8 Gb（Appels et al.，2018），卻大于已經(jīng)成功進行單細胞測序的絕大多數(shù)物種。因此，推測本實驗使用單細胞技術進行小麥單染色體擴增失敗的主要原因可能在于染色體的形態(tài)。染色體的高度濃縮超螺旋狀態(tài)會影響組蛋白的去除及DNA變性，一般的裂解條件可能無法使DNA從這種超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性且可以與引物有效結(jié)合的狀態(tài)，無法有效啟動復制。此外，染色體制備過程中殘留的固定劑、染色劑等成分可能會對組蛋白消化和DNA聚合酶反應等造成影響。

為成功使用單細胞測序技術進行單條染色體的體外擴增，建議從以下幾個方面進行嘗試：（1）整個操作過程必須保證完全的無菌環(huán)境，所使用的儀器、器皿等工具應嚴格高壓滅菌和紫外線滅菌;體外擴增試劑應選用經(jīng)過嚴格無菌化處理的商品化試劑盒;實驗用水和其他試劑必須進行嚴格的滅菌和質(zhì)量檢測，確保無外源DNA污染后方可使用;嚴格做好自身防護，減少人體裸露部位暴露在環(huán)境中的機會;全程設無菌水陰性對照;最好使用新建實驗室和新的超凈工作臺等進行操作，且需將染色體分離和擴增兩個環(huán)節(jié)在不同實驗室分開進行，避免氣溶膠的污染。（2）通過高鹽緩沖液、使用蛋白酶K消化、延長消化時間等措施盡量去除組蛋白，同時綜合運用生物酶（如拓撲異構酶等）、離心機械力等方法，盡可能地使染色體變?yōu)樗缮⒌木€性狀態(tài)。（3）評估染色體制備過程中不同藥劑對后續(xù)實驗的影響，選擇最合適的染色體制備和染色方法，并爭取在前處理過程中通過減少操作時間、中和反應和溶劑沖洗等措施降低或去除這種影響。建議使用較溫和的方法獲得染色體懸浮液后不經(jīng)染色直接使用微細玻璃針（管）吸取分離，進行后續(xù)裂解和擴增反應。本研究團隊在總結(jié)和深入解析單染色體測序失敗原因的基礎上，通過改進染色體懸浮液制備和分離方法，增加蛋白酶K消化等步驟，目前已成功分離和體外擴增了小麥的單條植物染色體，并經(jīng)過了Southern雜交驗證，但顯示雜交信號不是很強，目前正在進行質(zhì)量評估，相關研究結(jié)果將在后續(xù)文章中進行報道。

本研究針對使用單細胞測序技術進行單染色體體外擴增和測序過程中普遍遇到的擴增失敗和假陽性問題，進行了具體地分析和探討，并提出了可行性建議，為進一步改進植物單染色體擴增技術提供借鑒。

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（責任編輯 蔣巧媛）