香蕉MaARF2基因的克隆及序列表達分析

黃東梅 許奕 吳斌 馬伏寧 陳弟 李敬陽 林妃 宋順

摘 ?要：利用RT-PCR方法從巴西蕉（Musa acuminataL. AAA group，?cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因，并對其進行序列及表達分析?；蚩寺〗Y(jié)果獲得該基因編碼片段，命名為MaARF2，全長2655 bp，編碼884個氨基酸，分子量為97?917.38?Da，理論等電點pI為6.64，序列富含絲氨酸、脯氨酸，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均勻分布在整個肽鏈中;通過Motif Search工具發(fā)現(xiàn)了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family結(jié)構(gòu)域;多序列比對和進化樹分析表明，MaARF2基因編碼的蛋白與其他植物中ARF基因編碼的蛋白具有較高的一致性。qRT-PCR結(jié)果表明，MaARF2在香蕉根、莖、葉、花和果實中均表達， 其中葉片中表達水平最高，果實表達量最低;MaARF2在低溫、鹽和干旱脅迫后表達量均上調(diào)，表明其可能參與調(diào)控香蕉低溫、鹽和干旱脅迫響應的過程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因，為進一步研究該基因的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香蕉;生長素響應因子;克隆;序列分析中圖分類號：S667.9?????文獻標識碼：A

Cloning and Sequence Expression Analysis of MaARF2Gene?in Banana

HUANG Dongmei， XU Yi， WU Bin， MA Funing， CHEN Di， LI Jingyang， LIN Fei， SONG Shun^*

Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/ Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou， Hainan 571101，?China

Abstract： An auxin response factor gene from banana designated asMaARF2was amplified by RT-PCR， and its sequence and expression were analyzed. Sequence analysis indicated that the length of theMaARF2 ORF was?2655 bp， encoding 884 amino acids， the protein molecular weight was 97 917.38 Da， and the theoretical isoelectric point pI was 6.26. The amino acid sequence encoded by this gene was rich in serine and proline， and the hydrophilic amino acid was more than the hydrophobic amino acid and evenly distributed in the whole peptide chain. Through the Motif Search tools three domains including B3， Auxin_resp， and AUX_IAA family conformed to the structural features of ARF were found. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the protein encoded byMaARF2 was highly consistent with the protein encoded by ARF in other plants. qRT-PCR results showed thatMaARF2was expressed in banana roots， stems， leaves， flowers and fruits， among which the expression level in leaves was the highest and the expression level in fruits was the lowest. The expression ofMaARF2was up-regulated after low temperature， salt and drought stress， indicating thatMaARF2may be involved in the regulation of responses to these stresses in bananas.MaARF2was firstly cloned in this study， which would lay a foundation for further research on the biological function of this gene.

Keywords： banana; auxin response factor; clone; sequence analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.013

香蕉是世界鮮果貿(mào)易量和消費量最大的水果，也是我國熱區(qū)第一大水果和熱帶農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)^[1]。生長素相應因子（auxin response factor，ARF）是一類能夠特異結(jié)合生長素響應基因啟動子區(qū)域的元件AuxREs的TGTCTC/GAGACA結(jié)合并發(fā)揮激活或抑制作用的轉(zhuǎn)錄因子^[2]。ARF由B3、Auxin_resp以及AUX_IAA family?3個結(jié)構(gòu)域組成^[3]。ARF家族除了參與植物多種代謝途徑和生長發(fā)育過程，包括植物器官葉片、根等的形成以及果實生長發(fā)育等，還在植物響應脅迫相關(guān)代謝途徑或信號通路中發(fā)揮作用^[4-7]。在香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出47個ARF家族成員，較多的ARF成員報道是在香蕉受到旱害、冷害、鹽堿等脅迫后上調(diào)表達，其家族成員可作為抗逆育種的重要備選基因^[8]。

ARF2是一個多效性的轉(zhuǎn)錄因子，在所有組織中均有表達。ARF2在擬南芥和番茄中與植物葉片衰老^[9]、花器官衰落^[10]、側(cè)根的形成^[11]、果實成熟^[12]相關(guān)。擬南芥ARF2突變株與野生型植株相比表現(xiàn)出多效性發(fā)育表型，包括長下胚軸、大的深綠色的蓮座葉、大組織器官、植株更高、延遲開花、粗長的花序、早期形成的花、花形異常和不育、植株延緩死亡和脫落^[13]。ARF2與植物響應尖孢鐮刀菌侵染相關(guān)，其突變株在尖孢鐮刀菌侵染后比野生型表現(xiàn)出更好的抗性^[14]。在番茄中過表達ARF2A會導致斑點性成熟，而ARF2A沉默則會導致果實成熟抑制^[15]。在番茄和擬南芥中，ARF2的活性被Aux/IAA3調(diào)節(jié)，并與生長素-乙烯信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)^[16-17]。此外，ARF2還是一些miRNA的靶基因，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用^[18]。由此可見，ARF2在植物生長發(fā)育及多個信號通路中發(fā)揮重要作用。

本研究根據(jù)同源基因功能相似的原理，以擬南芥等模式植物作為參照，克隆香蕉ARF基因家族的MaARF2基因，通過生物信息學方法分析MaARF2基因序列和其編碼的氨基酸，獲得其蛋白結(jié)構(gòu)，并推測其生物學功能，同時對其表達模式及其在低溫脅迫、鹽脅迫以及干旱脅迫下的表達情況進行初步分析，為進一步研究該基因的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??實驗材料??將巴西蕉（Musa acuminataL. AAA group， cv. Brazilian）組培苗培養(yǎng)至“五葉一心”，經(jīng)過無菌水多次清洗，取莖葉組織用液氮速凍，碾磨提取RNA，其余材料保存于-80?℃冰箱。香蕉組培苗來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所香蕉課題組。

1.1.2??試劑盒、酶和化學試劑??從天根（TIANGEN）公司購買RNA分離試劑盒（DP441），從Fermentas公司購買反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）和限制性內(nèi)切酶，從TaKaRa公司購買DNA高保真聚合酶Prime STAR^?Max DNA Polymerase和ExTaq，從TaKaRa公司購買TA克隆載體（pMD19-T），感受態(tài)細胞（JM109）為實驗室制備和保存。從Axygen公司購買質(zhì)粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒，北京中科瑞泰公司購買DNA Marker，其他化學藥品為分析純。

1.2方法

1.2.1??總RNA提取及cDNA的獲得??將實驗材料用液氮研磨至白色粉末，利用植物總RNA分離試劑盒（DP441）提取總RNA。使用RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit （K1622）進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，cDNA保存于-80?℃冰箱中。

1.2.2 ?目的基因的獲得??根據(jù)同源克隆的原理，將擬南芥ARF2基因（ID：At05_g62000）編碼的氨基酸序列，通過香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫（http：//?banana-genome-hub.southgreen.fr/pahang_v2）Blast，獲得同源基因Ma06_t17950.3（MaARF2），根據(jù)其序列利用NCBI Primer-BLAST 工具設(shè)計引物，引物序列為A2F和A2R（A2F：5?-ATGGATTCCG G TGAGCTCG-3?;A2R：5?-AAAAGCC GTGC C A ATACTTGG-3?），以cDNA為模板擴增MaA RF2基因全長，擴增條件：98?℃預變性3 min;32個循環(huán)的98?℃?10 s，62?℃?5 s，72?℃?30 s; 再加入1 μLTaq酶，72?℃延伸20 min^[19]。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后利用回收試劑盒切膠回收，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，PCR鑒定，對鑒定陽性的克隆，回收并送至生工測序公司測序分析。

1.2.3??生物信息學分析??利用DNAMAN對測序的基因序列推導其編碼的氨基酸序列;利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https：//web.expasy.?org/protparam/）分析該基因的蛋白理化性質(zhì);利用在線軟件Protscale（http：//www.expasy.ch/tools/?protscale.html/）分析MaARF2編碼的蛋白的疏水性和親水性;利用在線軟件PredictProtein（https：//?www.predictprotein.org）分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位;利用在線軟件SWISS-MODEL（https：?//swi s smodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu);利用在線軟件分Motif Search（http：//www.genome.?jp/tools/motif/）對推導的MaARF2氨基酸序列進行生物學功能的位點分析。將MaARF2推導的氨基酸序列序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的Protein BLAST進行同源性搜索和比對;利用Clustal X2.1和GeneDoc進行MaARF2蛋白與其近源物種的ARF2氨基酸序列比對，并利用MEGA 5.1軟件，進行?ClustalW多重序列比對，Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其進化關(guān)系^[19]。

1.2.4MaARF2的組織表達分析??將巴西蕉“五葉一心”期小苗的根、莖、葉片、花和果實采集后液氮保存，所有材料提取總RNA，采用qRT-PCR 方法對其進行組織特異性表達分析。以香蕉MaActin片段為內(nèi)參。qRT-PCR反應中MaARF2引物序列為A2QF：5?-GGTGGCCTG G TTC AAA A TGG-3?和A2QR：5?-AAAGGA GGTTG TTCG TGG CT-3?;內(nèi)參基因引物序列為MaActinF：5?-CGAG GCTCAATCAAAGA-3?;MaActinR：5?-ACCAG CA AGGTCCAAAC-3?。采用2^?ΔΔCT法計算相對表達量。

1.2.5MaARF2響應不同脅迫的表達特性分析??以巴西蕉“五葉一心”期小苗為材料分別進行低溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫處理，進行MaARF2響應不同脅迫的表達特性分析。試驗均安排了3次重復。低溫脅迫：4?℃低溫處理22 h;鹽脅迫：300 mmol/L NaCl處理7?d;干旱脅迫：200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理7?d^[20]。處理完畢后取葉片組織進行MaARF2的定量表達分析。

2??結(jié)果與分析

2.1MaARF2的克隆和鑒定

以巴西蕉莖葉組織混合cDNA為模板，以A2F和A2R為引物，PCR手段克隆獲得約2600 bp長度的條帶，PCR結(jié)果如圖1所示。將片段回收克隆至T載體后測序結(jié)果顯示，該片段長度為2655?bp，將測序結(jié)果與香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫V2版本中比對，該序列與基因編號為Ma06_t 17950.3的序列完全一致，表明成功克隆到目的基因片段。

2.2生物信息學分析

2.2.1MaARF2編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析??利用ExPASy-ProtParam 軟件分析MaARF2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，MaARF2基因編碼884個氨基酸，分子量為97 917.38 Da，理論等電點pI均為6.64，分子式為C₄₃₁₁H₆₇₀₅N₁₂₁₉O₁₃₁₆S₃₉;不穩(wěn)定指數(shù)（insta bility index）為54.38，表明該蛋白不大穩(wěn)定;脂肪族指數(shù)（Aliphatic index）為65.25，親水性平均系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為-0.554，表明該蛋白為親水性蛋白。

利用Expasy的Protscale軟件分析MaARF2編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的親水疏水性分析，對氨基酸序列進行統(tǒng)計，其中MaARF2蛋白的非極性氨基酸共350個，疏水性氨基酸占總氨基酸比例39.6%，極性氨基酸共312個，堿性氨基酸共122個，酸性氨基酸共100個。MaARF2蛋白的氨基酸的組成比例見圖2，富含絲氨酸（S）、脯氨酸（P），甘氨酸（G），其中絲氨酸占比最高為10.29%，半胱氨酸占比最低為1.36%。MaARF2蛋白親水疏水性分析如圖3所示，親水性氨基酸（包括極性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸）數(shù)量高于疏水性氨基酸。與之前預測的總的親水性平均系數(shù)（GRAVY）值的預測結(jié)果相一致。

二級結(jié)構(gòu)組成中α-螺旋（helix）占6.45%，β-折疊（strand）占14.14%，環(huán)與無規(guī)則卷曲（loop）占79.41%，因此環(huán)與無規(guī)則卷曲及β-折疊是香蕉ARF2蛋白的主要結(jié)構(gòu)與元件，預測的亞細胞定位結(jié)果為細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的定位。三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖4所示。

2.2.2MaARF2編碼蛋白質(zhì)的Motif分析??通過Motif Search工具（http：//www.genome.jp/tools/?motif/）對推導的MaARF2氨基酸序列進行生物學意義的位點分析（圖5），在氨基酸序列172～273位點之間預測到1個B3 DNA 結(jié)合區(qū)域（DNA binding domain），在298～380位點預測到Auxin_response factor，在703～834位點預測到1個AUX_IAA family。根據(jù)預測結(jié)果，符合ARF的結(jié)構(gòu)特點。

2.2.3 ?MaARF2氨基酸序列比對??利用Clustal X2.1和GeneDoc將MaARF2cDNA推導的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其他高等植物的ARF2 like蛋白進行氨基酸序列比對，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）NP_851244.1、油棕（Elaeis guineensis）XP_010929664.1、海棗（Phoenix dactylifera）XP_008791039.1、番茄（Solanum lycopersicum）NP_001233765.1、粳稻（Oryza sativaJaponica Group）CAC83756.1、大豆（Glycine max）XP_003525433.1，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示它們在保守區(qū)域具有高度的同源性。

2.2.4??MaARF2進化樹分析??利用Protein ?BL A ST將MaARF2cDNA推導的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其他高等植物的ARF基因進行氨基酸序列比對，結(jié)果表明，MaARF2編碼的氨基酸序列與油棕Elaeis guineensisXP_010929664.1、海棗Phoenix dactyliferaXP_008791039.1、荷花Nelumbo nuciferaXP_010249209.1、菠蘿Ananas comosusXP_020106699.1、罌粟Papaver somniferum XP_026385608.1、甜橙Citrus sinensis NP_001275789.1、蘆筍Asparagus officinalisXP_020261175.1、落花生Arachis duranensis XP_015955707.1、粳稻Oryza sativaJaponica Group CAC83756.1、大豆Glycine maxXP_003 52 5433.1編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為70%、70%、65%、64%、64%、63%、63%、62%、61%、60%。利用Clustal X2.1和MEGA5.1軟件，將MaARF2所編碼的氨基酸序列與其他植物中的與該序列同源的氨基酸序列進行了系統(tǒng)進化樹的比對分析。結(jié)果表明香蕉MaARF2與上述的等高等植物的同源基因有較近的同源關(guān)系，具體的進化關(guān)系見圖7。

2.3MaARF2的組織表達分析

對巴西蕉不同組織MaARF2的表達水平進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，MaARF2在巴西蕉的根、莖、葉、花和果實中均有表達，為組成型表達，如圖8所示，該基因在不同組織部位中的表達水平順序依次為葉>根>莖>花>果實。

2.4MaARF2響應外源脅迫下的表達情況分析

為進一步了解該基因的功能，對MaARF2響應非生物脅迫包括低溫脅迫、鹽脅迫以及干旱脅迫下的表達情況進行分析，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明香蕉MaARF2的表達受低溫脅迫、鹽脅迫以及干旱脅迫誘導，表達量分別提高了9.5倍、4.0倍和13.7倍。

3??討論

香蕉是熱帶重要的水果和糧食作物，也是各學科研究的重要作物對象，其基因資源的挖掘和利用在生長發(fā)育相關(guān)領(lǐng)域具有重要意義。大量的研究表明，ARF作為生長素響應的轉(zhuǎn)錄因子，影響植物生長過程中各器官和組織的生長發(fā)育，在花器官及維管組織、葉器官、果實等的生長發(fā)育及植物抗逆中發(fā)揮作用^[21]。本研究克隆的ARF2基因是一個多效性的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育、抗逆性及多個信號通路中發(fā)揮作用^[22]。

本研究通過同源克隆得到香蕉生長素響應因子家族的MaARF2基因，對其序列推導蛋白的氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)其富含絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸等，Guilfoyle等^[23]提到ARF中間區(qū)富含谷氨酰胺、絲氨酸和亮氨酸殘基的ARF蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能;而如果中間區(qū)富含色氨酸、脯氨酸、亮氨酸和甘氨酸等殘基，則該ARF蛋白具有抑制作用。因此推測香蕉ARF2其具有轉(zhuǎn)錄抑制功能，前人的研究結(jié)果^[24]表明ARF2是植物地上部分組織器官細胞分裂的抑制子，可能通過負調(diào)節(jié)與細胞生長和衰老相關(guān)的信號通路下游的基因轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)，我們的推測與他人在其他作物中的研究結(jié)果一致。亞細胞定位預測結(jié)果為細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用的特點。通過Motif Search工具對序列進行生物學意義位點分析發(fā)現(xiàn)，MaARF2蛋白的氨基酸序列上具有典型ARF的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Auxin_response factor結(jié)構(gòu)域以及AUX_IAA family結(jié)構(gòu)域，符合ARF蛋白的結(jié)構(gòu)特點，ARF與AuxRE是正是通過B3 DNA識別而結(jié)合，C-末端的AUX_IAA family結(jié)構(gòu)域?qū)RF的功能也發(fā)揮重要的作用，其可以形成?ARF-ARF、ARF-Aux/IAA 二聚體互作，在低的生長素（Auxin）水平時，Aux/IAA、協(xié)同抑制子TOPLESS（TPL）和ARF蛋白結(jié)合，抑制生長素響應基因的表達;而在高生長素水平時，Aux/IAA和SCFTIR1/AFB形成復合子，被?26S 蛋白酶降解，ARF蛋白被釋放從而調(diào)控生長素響應基因的表達^[25]。通過NCBI的Blast工具分析其氨基酸序列的同源關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與其他高等植物包括模式植物或大宗作物的擬南芥、粳稻、大豆和番茄等的ARF2 like蛋白的氨基酸序列在保守區(qū)域具有較高同源性，進化樹結(jié)果也表明它們的序列相似性高，具有一定的親緣關(guān)系，可為其基因功能的預測作參考。

ARF2是一個多效性的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的多個生長發(fā)育過程。ARF2是組成型表達，在多個組織部位均有表達，Ren等^[11]研究結(jié)果表明番茄SlARF2在所有部位均有表達，尤其在花中表達量最高;姜倩倩等^[26]的研究結(jié)果也同樣表明平邑甜茶MhARF2為組成型表達，且在葉片中的表達水平最高。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，香蕉MaARF2在幾個不同的組織中均有表達，故推測為組成型表達，同時在不同的組織部位的表達水平有差異，以葉片中的表達水平最高，表明該基因可能在香蕉不同組織及生長發(fā)育不同時期中發(fā)揮著不同的調(diào)控功能。

ARF在生長素信號傳導過程中的作用已明確，生長素濃度時ARF與AUX/IAA蛋白質(zhì)結(jié)合形成不活化的異源二聚體，阻止早期基因的轉(zhuǎn)錄，生長素濃度較高時，AUX/IAA抑制子可以被SCFTIR復合體識別，泛素連接酶被活化，導致AUX/IAA蛋白泛素化，ARF與早期基因啟動子的生長素響應元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達^[7]。多個研究表明，ARF2在植物逆境脅迫調(diào)控中發(fā)揮作用。ARF2可參與擬南芥抗低鉀脅迫過程，低鉀條件下原本結(jié)合到K⁺轉(zhuǎn)運蛋白基因HAK5的啟動子區(qū)以抑制HAK5表達的ARF2蛋白被磷酸化，HAK5得以表達，促進K⁺的轉(zhuǎn)運^[27];ARF2及其調(diào)控的同源域基因HB33介導擬南芥ABA應答^[22];ARF2還與PLTs和PINs協(xié)調(diào)作用于ABA介導的根尖分生組織活性的調(diào)控^[28];ARF2是整合植物對干旱脅迫反應的分子鏈，ARF2-ANT-COR15A協(xié)同形成ABA介導的信號通路，調(diào)控擬南芥種子的抗旱性^[29]。本研究中，qRT-PCR結(jié)果顯示MaARF2響應低溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫，表達量上升，表明MaARF2可能參與該幾種脅迫調(diào)控過程，具體的調(diào)控機理有待進一步研究。

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