MFAP2在頭頸部腫瘤中高表達(dá)的臨床意義*

肖紅梅

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院頭頸腫瘤科(貴州遵義 563000)

頭頸部腫瘤是最常見(jiàn)的一大類惡性腫瘤，主要包括頸部、口腔頜面部位以及耳鼻咽喉部位的腫瘤，雖然腫瘤種類繁多，但約90%患者腫瘤屬于鱗狀細(xì)胞癌[1-3]。由于頭頸部腫瘤發(fā)病部位特殊，患者的生活品質(zhì)受到巨大影響。在臨床上，由于頭頸部腫瘤發(fā)病特征不明顯，因此患者確診時(shí)往往處于晚期，而目前臨床上頭頸部腫瘤的診斷主要還是影像學(xué)的檢測(cè)，諸如CT、MRI[4]，因而針對(duì)頭頸部腫瘤標(biāo)志物的探索，對(duì)于深入分析頭頸部腫瘤的致病機(jī)制以及患者預(yù)后判斷具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前頭頸部腫瘤標(biāo)志物主要是一些鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的分子，如硫酸軟骨素多糖蛋白4(CSPG4)[5]、鈣磷脂結(jié)合蛋白A2(Annexin A2)[6]等，但這些腫瘤標(biāo)志物在敏感性或特異性方面表現(xiàn)較弱，因此開(kāi)發(fā)新的針對(duì)頭頸部腫瘤的特異性腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高頭頸部腫瘤的診斷具有重大意義。微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白2(MFAP2)是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，與肌原纖維蛋白相互作用介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)微纖絲的功能[7]。以往的研究發(fā)現(xiàn)MFAP2在肥胖、糖尿病和骨質(zhì)疏松等疾病中發(fā)揮重要的功能[8-9]，然而關(guān)于MFAP2在頭頸部腫瘤中的研究還很少，MFAP2表達(dá)與頭頸部腫瘤臨床病理特征的聯(lián)系也未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析MFAP2在頭頸部腫瘤中的表達(dá)，特別是闡述其在早期頭頸部腫瘤中的意義，并分析其表達(dá)與臨床病理之間的聯(lián)系，為頭頸部腫瘤患者預(yù)后判斷提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 76例頭頸部腫瘤患者腫瘤組織及癌旁正常組織取材于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，于2017年1月至2019年8月取材于腫瘤切除手術(shù)中。其中女37例、男39例，50歲以上患者51例，50歲以下患者25例，患者TNM分期按照AJCC頭頸腫瘤第8版進(jìn)行分類。

1.2 TCGA頭頸部腫瘤樣本資料 TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)納入本研究中，其中正常組織44例，腫瘤組織520例，其中腫瘤組織取自Ⅰ期腫瘤患者27例，Ⅱ期患者71例，Ⅲ期患者81例，Ⅳ期患者264例。根據(jù)腫瘤組織T分期來(lái)分類，T1期62例，T2期303例，T3期125例。根據(jù)患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N0為未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病例數(shù)176例；N1定義為存在1～3個(gè)腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，病例數(shù)為67例，而N2定義為4～9個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，病例數(shù)為12例，N3定義為10個(gè)及以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，有8例患者。根據(jù)是否存在人乳頭瘤病毒(HPV)感染，520例頭頸部腫瘤患者中有41例HPV陽(yáng)性患者和80例HPV陰性患者，其余未納入的患者具體特征未明確。

1.3 TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析 運(yùn)用UALCAN在線工具(http://ualcan.path.uab.edu/)處理TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)，選擇TCGA分析模式，輸入MFAP2基因名，選擇TCGA數(shù)據(jù)集(head and neck squamous cell carcinoma)，然后選擇Expression，即可展示出癌旁組織和癌組織中MFAP2相對(duì)表達(dá)量，然后根據(jù)不同病理特征進(jìn)行分組分析MFAP2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料 臨床標(biāo)本取材于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科切除手術(shù)中，立即置于超低溫冰箱中保存，RNA提取試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司。用于熒光定量PCR的引物由上海生工有限公司合成，并HPLC驗(yàn)證。其余化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥公司。

1.5 組織中RNA的提取 取10 mg左右的組織，加入1 mL 的RNA提取試劑，在組織勻漿機(jī)下充分勻漿組織，室溫靜置裂解15 min。加入500 μL的三氯甲烷，充分振蕩，室溫靜置5 min后，在4℃下14 000g離心10 min，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，注意不要吸到白色中間層。加入500 μL異丙醇溶液沉淀RNA，白色沉淀即為總RNA，使用75%乙醇洗滌白色沉淀2次，風(fēng)干后，加入DEPC預(yù)處理的去離子水，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，加入基因組DNA去除試劑，去除殘余的基因組DNA，防止影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR法，采用ROX進(jìn)行熒光校正，分析方法采用2-ΔΔCT。MFAP2的上游引物序列為5′-CGCCGTGTGTACGTCATTAAC-3′, 下游引物序列為5′-CCATCACGCCACATTTGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小112 bp。

2 結(jié)果

2.1 MFAP2在TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá) TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中44例癌旁正常組織和520例腫瘤組織納入分析，見(jiàn)圖1表1，MFAP2基因在頭頸部腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步在不同腫瘤分期患者中分析MFAP2表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)27例Ⅰ期頭頸部腫瘤患者腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)較癌旁正常組織也顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其余分期患者的MFAP2表達(dá)水平均顯著高于正常組織，但不同分期患者腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，如圖2-A，表2。而根據(jù)腫瘤組織分期來(lái)分析MFAP2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在T1早期階段，腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)顯著增加(P<0.001)，而且在更高階段的T2和T3期腫瘤中MFAP2的表達(dá)進(jìn)一步升高，見(jiàn)圖2-B，表3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸部腫瘤組織和癌旁正常組織中MFAP2表達(dá)水平

2.2 TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中MFAP2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV感染的關(guān)系 176例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸部腫瘤患者腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)也顯著增加(P<0.001)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)與存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織的MFAP2表達(dá)無(wú)顯著的差異(P>0.05)。無(wú)論是HOV陽(yáng)性還是陰性患者，其腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)都顯著高于正常組織，而HPV陰性患者腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)則顯著高于HPV陽(yáng)性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

注：*P<0.001

表2 不同進(jìn)展階段頭頸部腫瘤組織中MFAP2表達(dá)水平

注：*與正常組織比較

2.3 分析76例頭頸部腫瘤患者腫瘤組織與癌旁組織中MFAP2 mRNA表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，76例正常組織的MFAP2 mRNA相對(duì)中位數(shù)表達(dá)水平為2.462(95%CI：2.228～3.039)，而腫瘤組織中MFAP2的相對(duì)中位數(shù)表達(dá)水平為5.366(95%CI：5.107～5.8)，76例腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)顯著高于癌旁的正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖4。

2.4 MFAP2表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性 根據(jù)中位數(shù)，將76例頭頸部腫瘤患者分為低表達(dá)組28例和高表達(dá)組48例。分析MFAP2表達(dá)與患者性別、年齡、TNM分期、腫瘤大小以及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端腫瘤轉(zhuǎn)移。如表1所述，腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)與頭頸部腫瘤患者性別和年齡均無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)。而根據(jù)患者TNM分析將作者分為Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ期，根據(jù)腫瘤大小是否>3 cm，分析發(fā)現(xiàn)低表達(dá)MFAP2組有24例患者腫瘤大小<3 cm，有4例患者的腫瘤大小>3 cm。而MFAP2高表達(dá)組有21例患者腫瘤大小<3 cm，27例患者腫瘤大小>3 cm，MFAP2表達(dá)水平與腫瘤大小密切相關(guān)(P<0.001)。76例患者中有36例遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者和40例無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者，其中36例遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者中MFAP2高表達(dá)有28例(77.78%)，而MFAP2低表達(dá)有8例(22.22%)。76例患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有33例，43例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。33例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)FAP2高表達(dá)組有26例(78.79%)，而43例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)FAP2高表達(dá)的有22例，MFAP2低表達(dá)的患者有21例。見(jiàn)表4。

注：A：根據(jù)患者分期分組，分析MFAP2在不同進(jìn)展階段的表達(dá)水平；B：分析MFAP2在不同腫瘤分期中的表達(dá)。*與正常組比較P<0.001

圖2 MFAP2在不同分期頭頸部腫瘤患者腫瘤組織中的表達(dá)

注：*與正常組織比較

注：A：根據(jù)患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，分析MFAP2的表達(dá)，N0為未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， N1定義為存在1至3個(gè)腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，N2定義為4～9個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，N3定義為10個(gè)及以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；B：按照患者有無(wú)HPV感染進(jìn)行分組分析MFAP2的表達(dá)。*與正常組織比較P<0.001；△與HPV陽(yáng)性腫瘤比較P<0.001

圖3MFAP2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV感染的關(guān)系

注：*P<0.001

圖476例頭頸部腫瘤患者腫瘤組織與癌旁組織中MFAP2的mRNA表達(dá)

表4 MFAP2基因的表達(dá)與頭頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 例

3 討論

頭頸部腫瘤由于病發(fā)部位特殊，患者的生活品質(zhì)受到嚴(yán)重的影響，臨床上頭頸部腫瘤主要包括甲狀腺癌、口腔癌、喉癌等[10]。臨床上頭頸部腫瘤的治療主要是以外科手術(shù)為主的綜合治療，這是由于外科手術(shù)治療在早期患者中療效較好，但70%以上的患者確診時(shí)已是中晚期，存在局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)，因此化療和放射治療等綜合治療方式在頭頸部腫瘤的治療得到認(rèn)可[11-12]。臨床研究中也發(fā)現(xiàn)頭頸部腫瘤的預(yù)后與腫瘤大小、是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等因素存在密切聯(lián)系[13-14]，另一點(diǎn)值得注意的是頭頸部腫瘤不同發(fā)病部位，臨床表現(xiàn)也比較復(fù)雜，而且頭頸部腫瘤的早期表現(xiàn)易被忽視[15]。生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)以及預(yù)后評(píng)價(jià)方面發(fā)揮著重要的作用，在頭頸部腫瘤中，生物標(biāo)志物的研究還不完善[16-17]。因此本研究從發(fā)現(xiàn)新穎的頭頸部腫瘤生物標(biāo)志物出發(fā)，分析其在腫瘤負(fù)荷以及治療效果評(píng)估方面的價(jià)值。

本研究首先利用生物信息學(xué)的方法分析TCGA頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)，由于樣本量較大，更有利于尋找新穎的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在520例頭頸部腫瘤組織中較正常組織顯著增加，說(shuō)明MFAP2極有可能在頭頸部腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。進(jìn)一步本研究分析了不同分期腫瘤患者組織中MFAP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)即使是早期患者，其腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)也大量增加(P<0.001)，而頭頸部腫瘤的早期診斷是對(duì)于提高頭頸部腫瘤患者預(yù)后至關(guān)重要。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MFAP2在頭頸部腫瘤不同進(jìn)展階段的意義，我們進(jìn)一步分析了MFAP2在不同腫瘤階段的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在腫瘤T1期，MFAP2的表達(dá)大量升高，腫瘤T1的MFAP2表達(dá)水平與更高進(jìn)展階段的腫瘤T2、T3期無(wú)顯著差異(P>0.05)，而在分析有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸部腫瘤患者和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中MFAP2的表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)MFAP2表達(dá)水平即使在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸部腫瘤患者中也顯著升高，這些證據(jù)都說(shuō)明即使在早期階段，MFAP2在頭頸部腫瘤組織中仍然是一個(gè)顯著表達(dá)升高的分子，其在頭頸部腫瘤的早期診斷中，具有非常大的潛力。人乳頭狀病毒(HPV)感染是頭頸部腫瘤的致病因素之一[18-19]，那么MFAP2在HPV介導(dǎo)的頭頸部腫瘤過(guò)程中有無(wú)作用呢？我們分析了MFAP2在HPV陰性和HPV陽(yáng)性的頭頸部腫瘤組織中的表達(dá)差異，需注意的是MFAP2在HPV陰性頭頸部腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于HPV陽(yáng)性的腫瘤組織，這說(shuō)明在頭頸部腫瘤中MFAP2與HPV也存在某種緊密的聯(lián)系，值得深入的研究探討。本研究進(jìn)一步采用臨床收集的頭頸部腫瘤標(biāo)本，驗(yàn)證頭頸部腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MFAP2在頭頸部腫瘤中高表達(dá)，并且我們也進(jìn)一步分析了MFAP2的表達(dá)與頭頸部腫瘤患者臨床病理特征之間的聯(lián)系，結(jié)果進(jìn)一步表明MFAP2與腫瘤大小、患者分期、腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都存在密切聯(lián)系，而與患者的性別和年齡無(wú)顯著的關(guān)聯(lián)。這些證據(jù)進(jìn)一步證明MFAP2作為頭頸部腫瘤患者預(yù)后的潛在價(jià)值，特別是對(duì)于早期患者來(lái)說(shuō)，具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)MFAP2在患者預(yù)后生存期以及治療反應(yīng)中的價(jià)值也值得進(jìn)一步深入的研究。