氯唑西林人工抗原的合成及其抗體的制備

張冬昊，趙桐桐，何擴

（河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室，河北張家口075000）

氯唑西林（cloxacillin，CLOX），屬于半合成類青霉素類抗生素[1]，主要用于治療動物的敗血癥、呼吸道感染、以及皮膚和軟組織感染，是治療牛乳腺炎的最佳用藥[2]。一度成為牲畜疾病預(yù)防和治療使用最多的抗生素類藥物之一。氯唑西林在畜禽養(yǎng)殖中的不規(guī)范使用，造成環(huán)境和食品中殘留的氯唑西林超標，嚴重影響食品的安全性與人體的健康。殘留主要危害有：可引起皮膚、消化道甚至呼吸道的過敏反應(yīng)；干擾人體的正常生理機能，影響兒童和青少年的生長發(fā)育；降低人體對致病菌的抵抗能力；由于革蘭氏陽性菌G＋對青霉素的耐藥性較高，可誘發(fā)耐藥性的產(chǎn)生；給出口帶來障礙，造成經(jīng)濟上的損失[3-8]。我國在2008 年的農(nóng)業(yè)部235 號公告規(guī)定氯唑西林在動物源組織中的限量值為300 μg/kg，牛奶中氯唑西林規(guī)定為不得超過30 μg/L[9]。目前檢測氯唑西林主要方法是高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，如章敏等[10]通過該方法對牛奶中氯唑西林的殘留量進行測定，線性范圍為5 ng/mL～1 000 ng/mL，且具有良好的相關(guān)系數(shù)，其樣品檢出限為15 ng/mL。李學(xué)民等[11]根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對河豚魚和鰻魚中氯唑西林殘留量進行檢測，此方法在國家標準的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化，其回收率達84.1%以上，檢出限為2.0 μg/kg。郭萌萌等[12]依據(jù)液質(zhì)聯(lián)用法，先將水產(chǎn)品中氯唑西林殘留提取凈化，后優(yōu)化質(zhì)譜條件快速準確地檢驗水產(chǎn)品氯唑西林的殘留，對氯唑西林的檢出限2.6 μg/kg。

酶聯(lián)免疫法是近年新興的一種快速檢測方法，主要應(yīng)用高度特異性抗原-抗體的免疫反應(yīng)與酶對作用底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)，具有快速便捷，操作簡單，適合現(xiàn)場快速篩選測定的特點[13-14]。該技術(shù)在食品中獸藥殘留檢測當中應(yīng)用最廣，國內(nèi)外已有許多檢測獸藥殘留的商品化酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒，具有良好的市場需求和遠大的發(fā)展前景。目前關(guān)于氯唑西林特異性抗原-抗體的合成還未有報道。本文首先采用碳化二亞胺法合成氯唑西林免疫抗原和檢測抗原，其次通過紅外光譜掃描鑒定，然后免疫小鼠得到氯唑西林抗體，最終對氯唑西林抗體的效價及其特異性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

氯唑西林：北納創(chuàng)聯(lián)科技有限公司；碳二亞胺鹽酸鹽 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimi，NHS）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）：上海晶純生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：Sigma 公司；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色液（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）：北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊血清：河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器（RH-2）：德國 IKA 公司；MULTISKAN MK3 酶標儀（Thermo Multiskan FC）：美國 Thermo Scientific 公司；紫外可見分光光度計（U-3900）：日立高新技術(shù)公司；雙杰電子天平（JJ100）：常熟市雙杰測試儀器廠；儀都離心機（TGL-16A）：金壇市岸頭儀都儀器廠。

1.3 試驗動物

5 周齡 SPF 級 KM 雌性小鼠[SCXK（京）2014-0004]：5 只，北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 氯唑西林人工抗原的制備及其鑒定

采用碳化二亞胺法制備氯唑西林人工完全抗原。稱取7.5 mg CLOX（氯唑西林標準品）、21.1 mg EDC（碳二亞胺鹽酸鹽）、8.5 mg NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）使其溶于 1.5 mL 的 DMF（N，N-二甲基甲酰胺），25 ℃避光，在磁力攪拌器上反應(yīng)4 h，制得A 液。稱取25 mg 的BSA 溶解于3.5 mL 0.01 mol/L pH 為7.4 的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，在 4 ℃下預(yù)冷反應(yīng)12 h，制得B 液。將溶液A 逐滴加入到溶液B 中使之充分混合，在磁力攪拌器下避光反應(yīng)12 h。將混合液裝入透析袋中，用 0.01 mol/L 的 PBS（pH 7.4）4 ℃下透析72 h，每8 h 換一次透析液，制得免疫抗原CLOX-BSA。-20 ℃保存。

同樣的方法將BSA 換成OVA，制得包被抗原CLOX-OVA。-20 ℃保存。

1.4.2 完全抗原的鑒定

用磷酸鹽緩沖液（PBS）按照一定比例稀釋CLOX、BSA、OVA 和 CLOX-BSA、CLOX-OVA，空白對照用PBS，在紫外分光光度計200 nm～400 nm 處開始掃描，然后對掃描得到的圖譜組合在一起，是否偶聯(lián)成功通過定性證明。

1.4.3 動物免疫

實驗動物飼養(yǎng)于河北北方學(xué)院實驗動物中心[SYXK（冀）2014-0062]，不控制它的飲水和進食。預(yù)測期為7 d，挑選取用5 只健康KM 雌性小鼠分別進行在腹腔部位進行免疫，1.00 mg/kg/次（以載體蛋白含量計算），每次免疫時間間隔為14 d，一共需要免疫5 次。第一次使用完全相同劑量的弗羅因德佐劑乳化抗原注射和免疫抗原混合均勻免疫小鼠，隨后接下來的第二次、第三次、第四次注射均可采用免疫完全相同量的不完全弗羅因德佐劑乳化抗原和免疫抗原混合均勻免疫小鼠，最后一次直接注射免疫抗原，來加強免疫。在第3 次免疫注射后的第7 天，從免疫注射的實驗小鼠中隨機取1 只小鼠進行斷尾采血，然后用間接ELISA法檢測抗體效價。最后一次加強免疫后第7 天，摘取小鼠眼球進行采血，在25 ℃下放置1 h，在4 ℃以下過夜，用離心機進行離心，采集其上清，在-20 ℃中保存[15]。

1.4.4 抗體效價的測定

用間接ELISA 測定氯唑西林抗體效價[16]。

包被抗原：將檢測抗原進行倍比稀釋，然后縱向加入酶標板，100 μL/孔，37 ℃條件下孵育 2 h，使用磷酸鹽洗液（phosphate buffered saline-tween，PBST）洗滌3 次，每次3min，拍干。封閉：將配制好的封閉液加入酶標板，200 μL/孔，4 ℃過夜保存；PBST 洗滌，拍干。加一抗：抗體用PBS 進行倍比稀釋，同時采集健康小鼠的血清（200×稀釋）作陰性對照，橫向加入酶標板，100 μL/孔，37 ℃條件下孵育1 h；PBST 洗滌，拍干。加酶標二抗：加辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠LgG（H+L），用PBS 按照 1 ∶2 000 體積比稀釋，100 μL/孔，37 ℃條件下孵育 1 h；PBST 洗滌，拍干。顯色：TMB 10 mL，100 μL/孔，避光顯色 5 min。終止：1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，100 μL/孔；用酶標儀讀取整板 OD450值。

1.4.5 抗體特異性的測定

用競爭法測定氯唑西林抗體的特異性[17]。

包被抗原：可根據(jù)1.4.4 用間接ELISA 測定氯唑西林抗體效價獲得抗原最佳包被濃度，每孔100 μL，在37 ℃條件下孵育2 h，用PBST 液清洗3 次，每次清洗時間為3 min，然后在濾紙上拍干。封閉：在酶標板中滴加5 %的羊血清，每孔加200 μL，在37 ℃下孵育1 h，用 PBST 液清洗 3 次，每次清洗時間為 3 min，然后在濾紙上拍干。加一抗：加入最佳工作濃度的氯唑西林抗體和不同濃度的氯唑西林標準品（或其他標品），此階段氯唑西林標準品抑制包被好得檢測抗原CLOX-OVA 與氯唑西林抗體反應(yīng)。根據(jù)1.4.4 用間接ELISA 測定氯唑西林抗體效價獲得本次試驗抗體最佳競爭濃度為 1 ∶32 000，首先將 2 mL PBS（pH 7.4）與2 μL 氯唑西林抗體進行混勻后，然后從中吸取200 μL液體加入6.2 mL PBS 中。即得到氯唑西林抗體最佳工作濃度。每孔50 μL，并加入不同濃度的氯唑西林標品（或其他標品），本試驗使用標品的濃度為：0.1、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL。分別加入到酶標板的每一行中，每孔50 μL，其中要做兩個對照組，陰性對照組使用氯唑西林抗體，陽性對照使用氯唑西林標品。在37 ℃下孵育1 h，用PBST 液清洗3 次，每次清洗時間為3 min，然后在濾紙上拍干。加酶標二抗：酶標二抗為加辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，遵照說明書，用 PBS 作稀釋，稀釋比例為 1 ∶5 000，每孔加 100 μL，在37 ℃下孵育1 h，用PBST 液清洗3 次，每次清洗時間為3 min。顯色：使用TMB 單組分顯色液，每孔加入100 μL，避光顯色 5 min。終止：1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，100 μL/孔；用酶標儀讀取整板OD450值。試驗分別測定各個濃度氯唑西林標品競爭后的OD450值，通過以下公式計算各個濃度的抑制率，然后以抑制率為縱坐標，添加氯唑西林標品濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制氯唑西林抗體的競爭曲線，得到氯唑西林抗體的IC50值和IC15值從而篩選出靈敏度最高的抗體。

式中：B空白為空白對照的 OD450值；B對照為陰性對照的OD450值；B樣品為添加各個濃度氯唑西林標品競爭后的OD450值。

按以上方法將氯唑西林標品換為其他藥品，通過計算得到其他藥品對氯唑西林抗體的IC50值，將其代入以下公式，得到其他藥品與氯唑西林抗體的交叉反應(yīng)率。使用4 種氯唑西林同種類抗生素：阿莫西林、哌拉西林、氨芐青霉素、甲砜霉素及3 種常用抗生素為四環(huán)素、鏈霉素、呋喃它酮，與氯唑西林抗體進行交叉反應(yīng)試驗。交叉反應(yīng)率的計算公式為：

1.4.6 抗體濃度的測定

將200 μL 氯唑西林抗體加入到3.8 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）中，充分混勻得到氯唑西林抗體稀釋液。將紫外分光光度計進行調(diào)零，使用PBS 當作空白對照，測定PBS 在波長為280 nm 處的吸光度值，將比色皿洗凈后，測定氯唑西林抗體稀釋液在波長280 nm 處的吸光度值，代入以下公式可得氯唑西林抗體濃度。重復(fù)以上操作3 次，求抗體濃度的平均值。

式中：A1為抗體蛋白在 280 nm 的吸光度值；A0為空白對照的吸光度值；1.35 為蛋白系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原的紅外光譜掃描鑒定結(jié)果

圖1 為 CLOX、BSA 和 CLOX-BSA 的紅外光譜圖。

圖1 CLOX-BSA 的紅外光譜圖Fig.1 The IR spectrum plot of CLOX-BSA

如圖1 所示，BSA 是典型蛋白質(zhì)紅外光譜，有4 個明顯吸收峰，分別在 1 532、1 653、2 933 cm-1和 3 300 cm-1處，其中1 532 cm-1處是酰胺中C=O 伸縮振動引起的吸收峰；1 653 cm-1處是酰胺中N-H 鍵彎曲振動引起的吸收峰；2 933 cm-1處是-CH2-基團和-CH3的吸收峰；3 300 cm-1處是-NH-基團的吸收峰。譜圖中氯唑西林分子有以下幾個明顯吸收峰：1 039 cm-1處為C-OC 伸縮振動峰；1 680 cm-1處和 1 714 cm-1處為 C=O 伸縮振動引起的吸收峰；3 398 cm-1處為Ar-OH 中的O-H伸縮振動引起的吸收峰。

由光譜圖可知CLOX-BSA 多處吸收峰與BSA 譜帶重合，具有較高相似度。但CLOX-BSA 在2 850 cm-1處有明顯吸收峰，BSA 光譜圖中沒有與之對應(yīng)的吸收峰存在。由此可以證明CLOX 已經(jīng)成功與BSA 偶聯(lián)，可以用于免疫。

圖2 為CLOX、OVA 和CLOX-OVA 的紅外光譜圖。

如圖2 所示，OVA 同BSA 一樣是典型蛋白質(zhì)紅外光譜，分別在 1 532、1 653、2 933 cm-1和 3 300 cm-1處有明顯吸收峰，其中1 532 cm-1處是酰胺中C=O 伸縮振動引起的吸收峰；1 653 cm-1處是酰胺中N-H 鍵彎曲振動引起的吸收峰；2 933 cm-1處是-CH2-基團和-CH3的吸收峰；3 300 cm-1處是-NH-基團的吸收峰。譜圖中氯唑西林分子有以下幾個明顯吸收峰：1 039 cm-1處為C-O-C 伸縮振動峰；1 680 cm-1處和 1 714 cm-1處為C=O 伸縮振動引起的吸收峰；3 398 cm-1處為Ar-OH中的O-H 伸縮振動引起的吸收峰。由圖2 可知OVA譜帶中有4 個明顯吸收峰，CLOX-OVA 譜圖中的吸收峰均可與之對應(yīng)，而且CLOX-OVA 擁有兩個OVA 光譜沒有的吸收峰，由此可以說明CLOX 與OVA 偶聯(lián)成功。

2.2 抗體效價的測定

第3 次免疫后7 d，間接ELISA 法測定血清中CAP 抗體效價可達1 ∶32 000。加強免疫后抗血清效價的測定結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，加強免疫后7 d，眼眶采血后測定血清中抗體效價最高可達1 ∶64 000，抗原最佳工作濃度是 1 ∶8 000，抗體最佳工作濃度是 1 ∶64 000。由此可證明CLOX 多克隆抗體制備成功。

圖2 CLOX-OVA 的紅外光譜圖Fig.2 The IR spectrum plot of CLOX-OVA

圖3 加強免疫后抗血清效價的測定Fig.3 Determination of antiserum titer after boosting immunization

2.3 抗體特異性的測定

氯唑西林抗體競爭曲線見圖4。

圖4 CLOX 抗體的競爭曲線Fig.4 Competition curve of CLOX antibody

繪制的氯唑西林抗體的抑制曲線，其回歸方程為y=-0.584 2x+0.939 1（R2=0.992 4），經(jīng)計算可得到 IC50值為（5.64±0.03）ng/mL，IC15值為（22.43±0.02）ng/mL。

利用間接競爭ELISA 法測定氯唑西林抗體與氨芐青霉素、阿莫西林、哌拉西林、甲砜霉素、四環(huán)素及鏈霉素等抗生素的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)結(jié)果見表1。

表1 氯唑西林抗體的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reaction rate of cloxacillin antibody

結(jié)果表明氯唑西林抗體具有良好特異性，與其他抗生素均無交叉反應(yīng)。

2.4 抗體濃度的測定

將抗體稀釋20 倍后，以PBS 為空白對照，用紫外分光光度計在波長為280 nm 下測定抗體濃度。根據(jù)公式，計算得到氯唑西林抗體濃度為2.96 mg/mL。

3 結(jié)論

由于氯唑西林相對分子質(zhì)量為436，只具有應(yīng)原性，而無免疫原性。所以在制備抗體時，它必須成功地與大分子蛋白偶聯(lián)，才能對動物進行免疫。常用載體蛋白有 BSA、OVA、RSA、HSA 等，其中 BSA 和 OVA 均含有多組自由羧基和氨基可在EDC 與NHS 的輔助下與CLOX 進行快速偶聯(lián)。使用此方法成功合成了免疫抗原CLOX-BSA 與檢測抗原CLOX-OVA?，F(xiàn)在對于鑒定人工抗原的方法主要紫外分光光度法、電泳鑒定法、紅外光譜法、質(zhì)譜法。由于分外光譜法操作較為簡單，結(jié)果較為準確且合成的氯唑西林抗原與載體蛋白BSA、OVA、CLOX 的光譜圖可以明顯區(qū)分，所以本次試驗使用紅外光譜法鑒定即可。目前對抗體純化的方法主要有鹽析（辛酸-飽和硫酸銨法）、全抗原親和純化、蛋白G 親和純化、載體蛋白親和純化。據(jù)文獻[18-20]報道表明：鹽析法提純效果最差且會造成大約為40%抗體的損失；全抗原親和純化純化效果較差，造成嚴重的抗體損失并降低抗體的親和常數(shù)；蛋白G 親和純化法純化效果較好，不會對抗體造成負面影響；載體蛋白親和純化法純化效果最佳，不僅可以去除多克隆抗體中識別載體蛋白的組分，而且可增強抗體的親和常數(shù)。本試驗采用辛酸-飽和硫酸銨法對抗體進行純化，純化效果未達到理想狀態(tài)。今后可嘗試其他方法對氯唑西林抗體進行純化，從而獲得最佳抗體。

本試驗采用二亞胺法制備了氯唑西林完全抗原進行免疫小鼠，成功制備了氯唑西林抗體。試驗獲得的氯唑西林抗體的效價均達1 ∶64 000，繪制的氯唑西林抗體的抑制曲線，其回歸方程為y = -0.584 2x +0.939 1，經(jīng)計算可得到 IC50值為（5.64±0.03）ng/mL，IC15值為（22.43±0.02）ng/mL，與其他藥品均無交叉反應(yīng)，特異性強。氯唑西林人工抗原的合成及其抗體的制備為食品安全檢驗試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。