超臨界CO2流體萃取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的工藝優(yōu)化

李金鳳，張旋，陶冬冰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

墨紅，又名朱墨雙輝，學(xué)名Rose chinensis Jacq“Crimsin Glory”H.T.[1]，是國(guó)內(nèi)食用玫瑰花種植的主要品種[2]。鞣質(zhì)是玫瑰花中重要的生理活性物質(zhì)之一，是以玫瑰為原料加工的食品澀味產(chǎn)生的主要來(lái)源[3]，是玫瑰花抗衰老和調(diào)節(jié)女性?xún)?nèi)分泌系統(tǒng)的重要抗氧化功能物質(zhì)之一[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鞣質(zhì)的抗氧化性研究已經(jīng)十分深入[5]，提取方法多為溶劑提取法、超聲波提取法等，提取率相對(duì)較低[6]，造成玫瑰鞣質(zhì)的利用不高，通常在加工過(guò)程中脫澀除去[7]，本文旨在研究以墨紅玫瑰花為原料，利用超臨界CO2萃取技術(shù)提高提取鞣質(zhì)的效率，優(yōu)化墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的提取工藝。對(duì)玫瑰功能性食品開(kāi)發(fā)起到一定的借鑒意義，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效、高價(jià)值的天然食品抗氧化劑、食品添加劑、研制功能性食品及開(kāi)發(fā)醫(yī)藥材料提供理論指導(dǎo)[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的原料為新鮮的玫瑰花，品種為法國(guó)墨紅玫瑰，采于云南七彩云花生物科技有限公司食用玫瑰花基地。

石油醚（30℃～60℃）、氯仿、丙酮、無(wú)水乙醇、甲醇（均為 AR 試劑）：國(guó)藥集團(tuán)；鞣花酸（C76H52O46，M=1 701.25）：Sigma 公司。

1.1.2 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary50）：美國(guó)Vrian；不銹鋼篩（20、40、60、80、100 目）：日本 AS ONE；超臨界萃取設(shè)備（HA121-50-02 型）：南通市華安超臨界萃取有限公司；真空冷凍干燥設(shè)備（Freezone2.5）：美國(guó)Labconco。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鞣質(zhì)的提取方法

1.2.1.1 工藝流程

墨紅玫瑰花→原料預(yù)處理（去除花托、留完整花瓣）→烘干→粉碎→預(yù)處理（過(guò)篩、脫脂）→超臨界CO2萃取→真空抽濾→收集濾液→測(cè)定

1.2.1.2 預(yù)處理方法

稱(chēng)取一定量的粉碎過(guò)篩后的墨紅玫瑰花粉末，用石油醚在60 ℃回流8 h 進(jìn)行脫脂，再用氯仿冷浸24 h處理，以除去色素、脂肪等雜質(zhì)[9]。

1.2.1.3 超臨界CO2萃取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取脫脂后的樣品，裝入萃取釜，密閉，在夾帶劑罐中裝入適量夾帶劑，控制超臨界CO2萃取儀器的萃取溫度、萃取壓力、分離溫度、分離壓力等條件，在超臨界狀態(tài)下進(jìn)行萃取，在一定時(shí)間后降壓，從分離柱得到提取液，然后減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，F(xiàn)olin-Denis法測(cè)定鞣質(zhì)含量，然后真空冷凍干燥得到粗提物[10]。

1.2.2 鞣質(zhì)的定量方法[11]

鞣質(zhì)的定量方法采用Folin-Denis 比色法。鞣質(zhì)類(lèi)化合物在堿性溶液中，可將磷鎢酸鈉還原并生成藍(lán)色化合物，顏色的深淺與鞣質(zhì)含量正相關(guān)，在760 nm 波長(zhǎng)比色，以鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再根據(jù)測(cè)得的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得對(duì)應(yīng)的鞣質(zhì)含量。

1.2.2.1 Folin-Denis 顯色劑的配制[12]

50 g 鎢酸納，10 g 磷鉬酸溶于含375 mL 水的燒瓶中，在加入25 mL 85%的磷酸，水浴回流2 h，冷卻后定容至500 mL 棕色容量瓶中保存。

Na2CO3飽和溶液：35 g 無(wú)水 Na2CO3于 70 ℃溶解在100 mL 水中，放置過(guò)夜。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

準(zhǔn)確配制0.102 mg/mL 的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)液加入裝有25 mL 水的50 mL 容量瓶中，再各加2.5 mLFolin-Denis 顯色劑，10 mL Na2CO3飽和溶液，搖勻定容，室溫下放置30 min 后比色，以平均吸光值與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作線(xiàn)性回歸分析[13]，得到回歸方程：y=51.929x+0.011 5（R2=0.997 3）。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

圖1 Folin-Denis 法測(cè)定鞣質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The calibration curve of tannin content

1.2.3 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取玫瑰干粉300 g，分別進(jìn)行夾帶劑的選擇（70%乙醇、水、50 %甲醇、60 %丙酮為夾帶劑，萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa、萃取時(shí)間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[13]；粉碎粒度（原料粒度為 20、40、60、80、100 目，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度60℃、萃取時(shí)間1h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[14]；萃取時(shí)間（萃取時(shí)間為 20、40、60、90、120、150、180 min，70 %乙醇夾帶劑、萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[15]；萃取溫度（20、30、40、50、60、70 ℃，70 %乙醇夾帶劑、萃取壓力20 MPa、萃取時(shí)間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[16]；萃取壓力（15、20、25、30 MPa，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度 60 ℃、萃取時(shí)間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度40 ℃、分離壓力 8 MPa）[17]；夾帶劑的流速（15、20、30 mL/min，70%乙醇夾帶劑，萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MP、萃取時(shí)間1 h、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[18]；夾帶劑用量（100、200、400、600、900、1 200 mL 乙醇，萃取溫度 60 ℃、萃取壓力20 MPa、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa時(shí)，夾帶劑流量 15 mL/min）[19]；分離溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度 60 ℃、萃取時(shí)間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離壓力8 MPa）[20]的超臨界CO2萃取單因素試驗(yàn)，從分離柱得到提取液，然后減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，F(xiàn)olin-Denis 法測(cè)定玫瑰鞣質(zhì)含量。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定影響鞣質(zhì)浸提率的因素主要有萃取壓力（A）、萃取溫度（B），萃取時(shí)間（C）、夾帶劑乙醇濃度（D），設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)樣品重300 g。

表1 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗(yàn)表Table 1 The project of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 夾帶劑的選擇

由于鞣質(zhì)是強(qiáng)極性的物質(zhì)，而超臨界CO2萃取對(duì)弱極性和非極性的物質(zhì)有較好的萃取效果，所以添加夾帶劑，改變超臨界流體的極性，可以提高鞣質(zhì)的提取率。夾帶劑選擇試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 夾帶劑的選擇Table 2 The selection of entrainers

由表2 可知，用70%乙醇和50%甲醇做夾帶劑玫瑰花鞣質(zhì)的提取率分別為33.10 mg/g 和32.93 mg/g，基本相同，用60%丙酮做夾帶劑，鞣質(zhì)提取率為34.14 mg/g，略高，水做夾帶劑鞣質(zhì)的提取率為27.97 mg/g，最低。但丙酮和甲醇都是有毒的有機(jī)溶劑，所以選擇乙醇做夾帶劑。

2.2 粉碎粒度對(duì)玫瑰花中鞣質(zhì)提取率的影響

原料粒度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 原料粒度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.2 Extraction effect of tannin from rose by granularity

由圖2 可知，當(dāng)原料粒度過(guò)細(xì)時(shí)，反而不利于玫瑰花中鞣質(zhì)的提取，主要是因?yàn)樵线^(guò)細(xì)不利于超臨界CO2流體從原料中通過(guò)，還可能造成原料堵塞萃取釜的過(guò)濾板，使流體進(jìn)入分離柱的量大大減少，使玫瑰花鞣質(zhì)的提取率降低。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，原料目數(shù)太高，對(duì)儀器的損害很大，減壓時(shí)會(huì)造成過(guò)濾板因內(nèi)外壓強(qiáng)不同而破裂，原料漏出，清理儀器時(shí)很困難，所以本試驗(yàn)最后選定40 目的原料進(jìn)行萃取試驗(yàn)。

2.3 萃取時(shí)間對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.3 Extraction effect of tannin from rose by time

由圖3 可以看出，當(dāng)萃取時(shí)間低于60 min 時(shí)，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，玫瑰花鞣質(zhì)的提取率逐漸增高，但超過(guò)60 min 后，提高靜萃取時(shí)間對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)的最終提取率影響并不顯著。這表明在60 min 時(shí)間段內(nèi)萃取劑CO2和夾帶劑乙醇已能較好地滲入玫瑰粉末，因此在以后的萃取過(guò)程中，萃取時(shí)間定為60 min。

2.4 萃取溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

萃取溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 萃取溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.4 Extraction effect of tannin from rose by temperature

由圖4 可知，在溫度小于60 ℃時(shí)，玫瑰花鞣質(zhì)提取率隨溫度升高而增大，即玫瑰花鞣質(zhì)在超臨界CO2流體中的溶解度隨著溫度的上升而增大，而溫度大于60 ℃以后，鞣質(zhì)的提取率隨溫度升高反而有減小的趨勢(shì)。

2.5 萃取壓力對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

萃取壓力對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 萃取壓力對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.5 Extraction effect of tannin from rose by pressure

由圖5 可知，隨著萃取壓力增大，玫瑰花鞣質(zhì)的提取率不斷升高。壓力的影響主要體現(xiàn)在改變超臨界CO2的密度和極性。在相同的溫度和夾帶劑用量下，加壓可以增加CO2的密度，減少分子間的傳質(zhì)阻力，增加溶質(zhì)與溶劑之間的傳質(zhì)效率，從而有利于目標(biāo)組分的萃取。但另一方面，壓力的增加會(huì)增加設(shè)備費(fèi)用，因此萃取壓力不宜過(guò)高，且由于使用的超臨界CO2萃取儀器具有過(guò)壓保護(hù)，壓力不能超過(guò)35 MPa。

2.6 夾帶劑流量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

夾帶劑流量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 夾帶劑流量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.6 Extraction effect of tannin from rose by entrainer fluence

由圖6 可知，通過(guò)夾帶劑泵加入的乙醇流速增大時(shí)，玫瑰花鞣質(zhì)的萃出速率有所提高；但當(dāng)乙醇流速低時(shí)，由于與玫瑰粉末接觸時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，則有利于玫瑰鞣質(zhì)總量的提高。

2.7 夾帶劑用量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

夾帶劑用量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 夾帶劑用量對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.7 Extraction effect of tannin from rose by entrainer dosage

由圖7 可知，隨著夾帶劑乙醇用量的增加，玫瑰花鞣質(zhì)的提取率急劇上升。但在900 mL 以后玫瑰鞣質(zhì)提取率的上升趨勢(shì)減緩。對(duì)于鞣質(zhì)這類(lèi)強(qiáng)極性物質(zhì)，夾帶劑用量的多少對(duì)改善玫瑰花鞣質(zhì)在超臨界CO2中的溶解性能具有決定性的影響。另一方面，當(dāng)夾帶劑量過(guò)高時(shí)，將會(huì)延長(zhǎng)萃取時(shí)間及增加操作成本，因此乙醇相對(duì)玫瑰粉用量在3 mL/g 為適宜。

2.8 分離溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響

分離溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖8。

圖8 分離溫度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)提取率的影響Fig.8 Extraction effect of tannin from rose by separation temperature

由圖8 可知，超臨界CO2流體在分離柱中降壓降溫后成為常壓氣體，這時(shí)鞣質(zhì)從流體中析出，當(dāng)分離溫度小于40 ℃時(shí)，隨著分離溫度的升高，鞣質(zhì)的析出逐漸增多，超過(guò)40 ℃后，上升趨勢(shì)不明顯，且超過(guò)50 ℃后，鞣質(zhì)的析出還略有下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榉蛛x溫度過(guò)高，超臨界流體有部分未能成為常壓氣體而造成鞣質(zhì)的析出減少。由此可知，分離溫度對(duì)鞣質(zhì)的提取率影響不大，考慮溫度升高需耗費(fèi)能源較多，所以分離溫度選用40 ℃。

2.9 超臨界CO2 萃取玫瑰花鞣質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果分析

超臨界CO2萃取法L（934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The results of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

續(xù)表3 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 The results of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

由表3 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀(guān)分析可知，萃取壓力對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)的提取率影響最大，而萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑乙醇濃度對(duì)玫瑰花鞣質(zhì)的提取率影響稍小，為了確定各因素對(duì)提取效果的影響及其顯著性，進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

由表4 方差分析結(jié)果分析，各因素對(duì)提取率的影響大小依次為：萃取壓力＞萃取時(shí)間＞夾帶劑濃度＞萃取溫度，最優(yōu)提取條件為：萃取壓力30 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間60 min、夾帶劑乙醇濃度50%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 5 The textual research

由表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果最終確定超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的最優(yōu)提取條件為：玫瑰花粉粒度40 目、萃取壓力 30 MPa、萃取溫度 60 ℃、萃取時(shí)間60 min、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa、夾帶劑乙醇濃度50%、流速15 mL/min、乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率為44.84 mg/g。

3 討論

超臨界CO2萃取玫瑰花中鞣質(zhì)的試驗(yàn)分別用丙酮、乙醇、甲醇、水做夾帶劑，增強(qiáng)超臨界流體的極性[19]，以提高鞣質(zhì)的提取率，用丙酮、乙醇和甲醇做夾帶劑，鞣質(zhì)的提取率基本相同，只有水偏低。本文研究所提取的玫瑰花中的活性成分主要用于食品與保健品工業(yè)，必須達(dá)到綠色食品要求，因此考慮到溶劑的安全性、有效性、生產(chǎn)成本及操作上的后續(xù)工作等因素，本試驗(yàn)選用乙醇作為超臨界CO2萃取的夾帶劑，既保證了玫瑰花鞣質(zhì)的順利溶出，也便于后續(xù)工作特別是產(chǎn)品的應(yīng)用生產(chǎn)。試驗(yàn)采用玫瑰花粉末作為提取原料，當(dāng)原料粒度過(guò)細(xì)時(shí)，不利于超臨界CO2流體從原料中通過(guò)，還可能造成原料堵塞萃取釜的過(guò)濾板，使流體進(jìn)入分離柱的量大大減少，使玫瑰花鞣質(zhì)的提取率降低[20]。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，原料目數(shù)太高，對(duì)儀器的損害很大，減壓時(shí)會(huì)造成過(guò)濾板因內(nèi)外壓強(qiáng)不同而破裂，原料漏出，清理儀器時(shí)很困難，所以，找到最適合的原料粉粹粒度對(duì)超臨界CO2萃取的提取率也有著較大影響。

4 結(jié)論

超臨界CO2萃取法提取玫瑰花中鞣質(zhì)的最優(yōu)提取工藝為：玫瑰花粉粒度40 目、萃取壓力30 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間60 min、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa、夾帶劑乙醇濃度50%、流速15 mL/min、乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率為44.84 mg/g。