基于EST-SSR標(biāo)記的西雙版納苦茶資源遺傳多樣性分析

尚衛(wèi)瓊，李友勇，劉悅，段志芬，楊盛美，李慧，許燕，劉本英

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省茶樹(shù)種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心，云南昆明666201）

云南作為茶樹(shù)的原產(chǎn)地，具有豐富的茶樹(shù)種質(zhì)資源。在茶樹(shù)種質(zhì)資源收集方面，云南現(xiàn)在共收集保存有茶組植物31個(gè)種和2個(gè)變種，而其中作為云南特有的就有21個(gè)種[1]。張宏達(dá)[2]將茶組植物分為4個(gè)系：五室茶系、五柱茶系、禿房茶系和茶系。目前，西雙版納茶組植物共有3個(gè)系，7個(gè)種和2個(gè)變種，其中以普洱茶種（Camellia assamica）分布最廣，而苦茶（Camellia assamica var.kucha）作為其中的一個(gè)變種，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化，其脂型兒茶素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非脂型兒茶素的含量，在制作發(fā)酵程度較高的茶類中表現(xiàn)出很高的優(yōu)勢(shì)，蘊(yùn)含著抵抗各種逆境所需要的基因，是茶樹(shù)品種中的寶貴資源。另一方面，苦茶種質(zhì)資源在西雙版納傣族自治州境內(nèi)有大面積分布，主要集中在勐?？h布朗山、景洪市勐龍鎮(zhèn)和勐臘縣易武鎮(zhèn)一帶。而由于西雙版納地貌多為中低山和丘陵區(qū)，茶區(qū)位置偏僻，交通不便，前人對(duì)優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源的收集多集中于地方種質(zhì)的收集，極大地限制了茶樹(shù)遺傳多樣性種質(zhì)資源的研究和育種材料創(chuàng)制，有大量的茶樹(shù)資源未開(kāi)展系統(tǒng)鑒定。

在分子鑒定方面，雖然前人對(duì)云南大葉茶資源進(jìn)行了大量的研究[3-8]，但針對(duì)苦茶種質(zhì)資源的研究鮮有報(bào)道，導(dǎo)致一些苦茶資源優(yōu)良品種還沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)和利用。EST-SSR技術(shù)具有成本低、通用性好、條帶清晰、帶形容易統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在茶樹(shù)遺傳多樣性、指紋圖譜、分子鑒別等研究上得到了很好的應(yīng)用，是一種非常有效、可靠的分子技術(shù)[9-10]。

本研究通過(guò)利用28對(duì)SSR引物對(duì)西雙版納傣族自治州境內(nèi)的50份苦茶種質(zhì)資源進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記方法遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，旨在初步探索西雙版納州境內(nèi)苦茶種質(zhì)資源的多樣性，為后期的優(yōu)良種質(zhì)資源收集、保護(hù)和利用提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料共50份，分別來(lái)源于西雙版納傣族自治州景洪市勐龍鎮(zhèn)、勐?？h布朗山鄉(xiāng)和勐臘縣3個(gè)地區(qū)，其中，有23份采自景洪市勐龍鎮(zhèn)勐宋鄉(xiāng)曼邁瑤村民小組，海拔1 650～1 780 m，樣品編號(hào)1～23號(hào)；15份采自勐海縣布朗山鄉(xiāng)老曼峨村，海拔1 650 m左右，樣品編號(hào)24～38號(hào)；12份采自勐臘縣瑤區(qū)南貢山，海拔1 470 m左右，樣品編號(hào)39～50號(hào)。利用硅膠對(duì)苦茶樣的新梢一芽二葉進(jìn)行干燥處理，制成試驗(yàn)樣品，并記錄樣品信息、編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取將各份試驗(yàn)材料分別進(jìn)行打樣磨碎，采用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，稀釋至20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物及PCR擴(kuò)增將28對(duì)SSR引物用于樣品材料的擴(kuò)增，其序列參照文獻(xiàn)[12]。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為10μL，包括上下游引物各0.2μL，10×Buffer（Mg2+）1μL，dNTP 0.2μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓170 V，時(shí)間120 min。銀染顯色，使用凝膠成像儀拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

電泳圖上的條帶處理參照張成才等[13]的方法進(jìn)行，將電泳圖上的條帶由大到小按照A、B、C、D、E等依次賦值，缺失條帶以“-”表示，統(tǒng)計(jì)樣品材料的基因型。28對(duì)引物中的SSR07引物和SSR19引物擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖1所示。

使用Popgene軟件計(jì)算每對(duì)引物的等位位點(diǎn)數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、等位基因頻率、基因型數(shù)和遺傳距離等，通過(guò)PIC-CALC 0.6計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量，按UPGMA軟件繪制聚類圖[14]，分析其遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源苦茶資源的遺傳多樣性分析

由表1可知，28對(duì)SSR引物在50個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)出127個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為3～6個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)為4.53；Shannon信息指數(shù)為0.92～1.70，最小為SSR01位點(diǎn)（0.92），最大為SSR09位點(diǎn)（1.70），平均每個(gè)位點(diǎn)為1.25，除SSR01、SSR02和SSR17這3個(gè)位點(diǎn)的Shannon信息指數(shù)小于1外，其他位點(diǎn)都大于1；觀測(cè)雜合度數(shù)值為0.404～1.000，最小為SSR09位點(diǎn)（0.404），最大為SSR23位點(diǎn)（1.000），平均為0.709；期望雜合度數(shù)值為0.506～0.814，最小為SSR01位點(diǎn)（0.506），最大為SSR09位點(diǎn)（0.814），平均為0.676；多態(tài)性信息含量數(shù)值為0.444～0.777，最小為SSR01位點(diǎn)（0.444），最大為SSR09位點(diǎn)（0.777），平均為0.614。SSR17位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3個(gè)，具有較低的遺傳重要性，而SSR07、SSR09這2個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)均為6個(gè)，說(shuō)明在群體遺傳結(jié)構(gòu)中具有較高的重要性。位點(diǎn)SSR01（0.444）、SSR02（0.476）和SSR24（0.499）的多態(tài)性信息含量在0.25～0.50，這3個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度的遺傳多樣性，其他25個(gè)位點(diǎn)都大于0.5，表現(xiàn)為高度遺傳多樣性，表明50份供試的西雙版納苦茶資源材料具有豐富的遺傳多樣性。

表1 28個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性信息參數(shù)

2.2 不同來(lái)源苦茶資源的遺傳分化分析

表2 材料來(lái)源地間的遺傳分化

續(xù)表2

對(duì)50份西雙版納苦茶材料的不同來(lái)源地間遺傳分化進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，同一來(lái)源地內(nèi)基因多樣性平均值為-1，且全部引物均為-1，表現(xiàn)為雜合體偏高；不同來(lái)源地間遺傳分化系數(shù)平均為0.803 8，表明80.38%的遺傳分化系數(shù)存在于材料不同來(lái)源地間；材料不同來(lái)源地間基因流平均為0.061 0，基因流較大，說(shuō)明不同來(lái)源地間基因交流程度很高，表明本試驗(yàn)中50份苦茶材料的遺傳變異多樣性主要是由不同來(lái)源地之間產(chǎn)生的。

2.3 聚類圖與遺傳多樣性分析

50份供試材料基于Nei's遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖如圖2所示，在大類群中，將50份苦茶資源材料分為四大類，其中，17號(hào)和22號(hào)、1號(hào)和2號(hào)各2份材料分別單獨(dú)聚為一個(gè)大類，其他的46份材料則分散分布于聚類圖中，形成2個(gè)大類。各2份供試材料均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，5號(hào)和12號(hào)的遺傳距離最小，為0.37，相似度為0.690 8；6號(hào)和21號(hào)的遺傳距離（0.458 1）次之，相似度為0.632 5；19號(hào)和25號(hào)的遺傳距離為0.556 6，相似度為0.573 2。從整個(gè)遺傳聚類圖來(lái)看，聚類結(jié)果與多態(tài)性信息含量等參數(shù)值分析結(jié)果一致，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

3 結(jié)論與討論

西雙版納苦茶資源作為一種特異資源具有重要的研究?jī)r(jià)值和利用潛力。多態(tài)性信息含量作為茶樹(shù)資源的遺傳多樣性重要指標(biāo)，小于0.25時(shí)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性，大于0.25小于0.50時(shí)為中度多態(tài)性，大于0.50時(shí)為高度多態(tài)性。本研究通過(guò)利用28對(duì)SSR引物對(duì)西雙版納傣族自治州境內(nèi)的50份苦茶資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果得出，其多態(tài)性信息含量為0.444～0.777，25對(duì)引物表現(xiàn)高度多態(tài)性，說(shuō)明作為供試材料的50份苦茶資源具有豐富的遺傳多樣性。李丹等[15]利用ISSR分子標(biāo)記分析江華苦茶群體的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，結(jié)果表明，江華苦茶群體基因組DNA具有較高的多態(tài)性，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果也符合前人對(duì)大葉種茶和小葉種茶的研究結(jié)果[16-19]。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，50份苦茶供試材料可分為4個(gè)大類和多個(gè)亞群。親緣關(guān)系樹(shù)狀圖在分子水平上顯示了西雙版納苦茶群體各單株間的親緣關(guān)系，各2份供試茶樹(shù)資源間均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，遺傳距離最小的為5號(hào)和12號(hào)（0.37），其相似度為0.690 8，整個(gè)遺傳圖譜表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，可能與茶樹(shù)資源來(lái)源于不同地區(qū)有極大的關(guān)系。這與劉本英等[20-21]研究云南大葉茶和野生茶的遺傳多樣性分析結(jié)果一致。

西雙版納具有豐富的苦茶資源，其遺傳多樣性豐富，但是現(xiàn)階段對(duì)苦茶資源的研究甚少，苦茶資源的研究、開(kāi)發(fā)及利用工作緩慢，對(duì)加快構(gòu)建茶樹(shù)資源核心種質(zhì)庫(kù)、分子指紋圖譜等研究具有一定的影響，為此，加快西雙版納苦茶資源的分子技術(shù)研究，發(fā)掘一批功能性成分超常量的特異資源及特色茶樹(shù)品種，篩選出有價(jià)值的特異資源和綜合性狀優(yōu)良的苦茶種質(zhì)資源，對(duì)保護(hù)和利用好云茶資源具有非常重要的意義。