長尾倉鼠VKORC1基因的提取與擴增

楊新根，楊靜，張建珍，郭紅芳，王庭林，鄒波，常文英，侯玉

（1.山西省農業(yè)科學院植物保護研究所，農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點試驗室，山西太原030031；2.山西大學生命科學學院，山西大學應用生物學研究所，山西太原030006）

長尾倉鼠（Cricetulus longicaudatus Milne-Edwards）是我國華北旱作地區(qū)重要的農田害鼠之一，主要分布在河北、山西、內蒙古、陜西、甘肅、青海、新疆、西藏、四川等地。長尾倉鼠一般棲息于海拔較高的次生闊葉林地帶和較干燥的荒地、灌草叢和農田等。根據(jù)山西省農業(yè)科學院植物保護研究所調查數(shù)據(jù)，在山西省，長尾倉鼠是大部分農田的優(yōu)勢鼠種（晉城、臨汾、長治、呂梁、晉中、太原、忻州等地）[1-4]，有些區(qū)域其所占比例達到70%以上（晉中、太原、忻州等地），是制約山西省農業(yè)健康發(fā)展的重大害鼠。

目前，防治長尾倉鼠的主要藥劑為殺鼠靈、溴敵隆、氟鼠靈等抗凝血滅鼠劑。此類滅鼠劑的作用機制是通過干擾維生素K的代謝，破壞鼠類的正常凝血功能而致其死亡[5-6]。抗凝血類滅鼠劑具有作用時間長（一般在鼠類食用3 d后致鼠死亡，不會引起鼠類的警覺）、相對比較安全、適口性好、滅鼠效率高等優(yōu)點。因此，目前世界各國一般均采用此類藥物對鼠類進行防控。但隨著抗凝血殺鼠劑的廣泛使用，鼠類抗藥性種群開始在多個地區(qū)出現(xiàn)。自BOYKE[7]于1960年首次在英國的一家牧場發(fā)現(xiàn)褐家鼠對殺鼠靈產生抗藥性以來，DODSWORTH[8]也于1961年在瑞典發(fā)現(xiàn)了小家鼠抗性種群的存在。此后陸續(xù)有許多西方國家發(fā)現(xiàn)了產生抗藥性的“超級鼠”種群。

20世紀80年代，我國開始推廣應用抗凝血殺鼠劑，并取得了比較滿意的成果。但之后在我國的湖南、廣東和上海等用藥時間較久的地區(qū)開始出現(xiàn)抗藥性害鼠[9-14]。據(jù)前人報道，黃胸鼠（Rattus tanezumi）對殺鼠靈的抗性率于2000年在長沙市達到了72.72%，1999年在湛江地區(qū)為17.7%，2003年在廣州市為45.2%；另外，在2003、2004年的廣東省不同市區(qū)，小家鼠（Mus musculus）對殺鼠靈的抗性率為27.8%～50.0%。同時，由于害鼠對抗凝血滅鼠劑的交叉抗性，而目前對于新藥的研制又面臨著難度大、周期較長的問題，所以，如果害鼠對第2代抗凝血劑產生了抗藥性，鼠害的防治工作將變得更加困難。

有研究報道，嚙齒動物維生素K的代謝主要依靠維生素K環(huán)氧化物還原酶（vitamin K epoxide reductase，VKOR），而編碼VKOR的基因——維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）基因突變可能導致VKOR活性抑制，進而阻斷抗凝血殺鼠劑與VKOR的結合，使鼠類產生抗藥性[15-19]。因此，應用分子生物學的手段，分析鼠類VKORC1基因的突變位點，預測編碼蛋白結構，并且探究其對鼠類抗藥性的影響，是近年來鼠類抗性研究領域的熱點。

本試驗擬對長尾倉鼠的VKORC1基因片段進行擴增并獲得其序列，可為探究長尾倉鼠VKORC1基因與其抗藥性的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物試驗鼠捕自山西省忻州市五臺縣，對每只鼠稱質量、鑒定性別并編號。

1.1.2 主要儀器微量臺式冷凍離心機5424R型，Eppendorf公司生產；T100熱循環(huán)儀，美Bio Rad公司生產；電泳儀BG-Power6000型，北京省晶生物科技公司生產；干燥箱2XDP-B2120型，上海智誠分析儀器有限公司生產；滅菌鍋G-I54DWS型，廈門致微科技公司生產；凝膠成像儀Alpha Imagertech型，美國Protein Simple公司生產。

1.1.3 主要試劑血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，北京天根公司生產；無水乙醇，天津市大茂化學試劑廠生產；PCR試劑，北京天根公司生產；PCR引物，上海生工生物工程股份有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取采集長尾倉鼠尾尖作為DNA提取材料，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有目標條帶后，對其進行定量分析。

1.2.2 PCR擴增與測序

1.2.2.1 引物設計從GenBank中下載與長尾倉鼠親緣關系較近的8種鼠的VKORC1基因序列（表1），應用GeneDoc軟件比對8個序列，選擇保守區(qū)域，應用PCR引物設計軟件Primer Preimier 5.0設計引物，并確保擴增產物含有相互重疊的區(qū)域，分別長約700、600 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物設計中使用的8種嚙齒動物VKORC1基因序列

1.2.2.2 PCR擴增以提取得到的長尾倉鼠全基因組DNA為模板，應用設計的引物進行PCR擴增。經(jīng)多次試驗優(yōu)化反應體系，摸索出擴增條帶較好的反應體系（表2）。

表2 PCR反應體系

PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53.1℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃5 min。采用2%瓊脂糖凝膠檢測是否有目標條帶。

2 結果與分析

2.1 引物設計

使用GeneDoc軟件對與長尾倉鼠親緣關系較近的8種鼠的VKORC1基因序列進行比對（圖1）。經(jīng)過比對后選取其中較為保守的區(qū)域：引物1所選上游引物為660區(qū)域，下游引物為1380區(qū)域；引物2所選上游引物為820區(qū)域，下游引物為1430區(qū)域。經(jīng)PCR引物設計軟件Primer Preimier 5.0設計出2對引物（表3）。

表3 PCR使用的引物

2.2 擴增產物檢測

PCR擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，得到目標條帶（圖2）。

擴增產物檢測使用的DL 5000 Marker（圖2），在500～750 bp的條帶即為目標條帶。本試驗以長尾倉鼠的全基因組為模版，與特異引物進行結合，擴增出了長度700、600 bp的條帶。條帶與預測基因片段大小一致，為目標條帶。

3 結論與討論

目前，隨著分子生物學的高速發(fā)展，PCR技術與引物設計所涉及到的各種軟件也得到了相應的大力開發(fā)。同時，公共的數(shù)據(jù)庫可提供大量的生物信息學數(shù)據(jù)?？蒲泄ぷ髡呖梢酝ㄟ^BIOSINO、Gen-Bank等開放的數(shù)據(jù)庫，便捷地獲得目標生物信息，并由此應用相應軟件設計引物以獲取目標條帶，提高測序和分析效率[18]。本研究能夠獲得長尾倉鼠VKORC1基因片段，探究長尾倉鼠VKORC1基因與其抗藥性的關系，正是基于分子生物學各項技術的長足發(fā)展及上述公共數(shù)據(jù)庫的建立健全。

嚙齒動物的抗藥性表現(xiàn)在多個方面，包括行為抗性、生理抗性和遺傳抗性等。其中，抗性種群體內維生素K環(huán)氧化物還原酶VKOR的活性抑制是鼠類對抗凝血滅鼠劑產生遺傳抗性的主要原因之一[19]。作為編碼VKOR的重要基因，VKORC1的突變與否，是嚙齒動物對抗凝血殺鼠劑是否產生抗性的重要指標之一。因此，探究嚙齒動物的VKORC1基因，探索抗藥性監(jiān)測新途徑，對于控制抗性蔓延、降低鼠害程度具有重要意義。