中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與肺疾病研究進(jìn)展

徐蘇晴 常明 盧紅艷

中性粒細(xì)胞在機(jī)體對(duì)抗病原的先天免疫中起著關(guān)鍵作用。在感染早期，中性粒細(xì)胞在蛋白水解酶、抗菌蛋白和活性氧(Reactive oxygen specie, ROS)幫助下遷移到感染部位，吞噬并殺死細(xì)菌。Brinkmann[1]于2004年發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在細(xì)胞外產(chǎn)生一種由組蛋白、DNA和蛋白酶(Elastinase, NE)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps, NETs)。中性粒細(xì)胞形成NETs的過程被稱為NETosis，這是一種有別于細(xì)胞壞死和凋亡的特殊細(xì)胞死亡程序。在NETosis過程中，核膜、細(xì)胞核和顆粒膜裂解并融合，細(xì)胞膜保持完整。盡管NETs在病原體防御中起重要作用，但其產(chǎn)生過量或降解不足也會(huì)導(dǎo)致宿主損傷。NETs在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)等疾病中已有較多研究。本文將綜述中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在細(xì)菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部腫瘤導(dǎo)致肺疾病中的作用。

NETs的概述

一、NETs的結(jié)構(gòu)特征

NETs是以DNA為骨架，其間鑲嵌多種蛋白成分的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白成分主要是組蛋白，其次是粒狀酶和多肽，包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、瓜氨酸組蛋白3(Citrulline histone, Cith3)、組織蛋白酶G、白細(xì)胞蛋白酶3、乳鐵蛋白、明膠酶、溶菌酶C、鈣保護(hù)素、中性粒細(xì)胞防御素和組織殺菌素。在電鏡下，NETs的基本骨架是直徑約17 nm的染色質(zhì)，周圍包繞直徑約50 nm的顆粒蛋白等顆粒狀物質(zhì)，NETs可為破碎或棉樣結(jié)構(gòu)，也可為線狀、網(wǎng)狀、膜狀或點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。NETs中DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和附著蛋白的完整性為其捕獲病原體功能提供保障[2]。

二、NETs的生成

生物體或病原體產(chǎn)生的各種生物分子均可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化，中性粒細(xì)胞活化產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox 2)，釋放大量ROS，通過與Toll樣受體4 (Toll-like receptors 4, TLR4)結(jié)合，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞核膜分裂[3]。此外，細(xì)胞內(nèi)NE和MPO通過中性粒細(xì)胞核膜分裂向細(xì)胞核遷移，部分降解特定的組蛋白，促進(jìn)染色質(zhì)解凝。肽賴氨酸脫氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4, PAD4)誘導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化將進(jìn)一步促進(jìn)染色質(zhì)解凝。染色質(zhì)解凝后，疏松的染色質(zhì)與顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)和各種蛋白質(zhì)混合，然后全部進(jìn)入細(xì)胞外空間，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4]。

三、NETs的免疫逃逸

免疫逃逸是病原體通過其結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)物質(zhì)，拮抗、阻斷和抑制機(jī)體免疫應(yīng)答從而加重病原體對(duì)人體危害的方式。NETs對(duì)多種病原體均有不同程度的抗感染作用，而這些病原體也通過不同方式逃避NETs捕獲。病原體可釋放IL-10抑制劑阻斷TLR誘導(dǎo)的ROS生成或利用核酸酶來攻擊NETs的DNA骨架，從而阻斷NETs的生成，進(jìn)行免疫逃避[5]。病原體還可通過表面蛋白分子，負(fù)性調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性，從而抑制NETs的生成[6]。

NETs與肺疾病

多種因素均可導(dǎo)致肺部疾病，例如細(xì)菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部腫瘤等。這些因素導(dǎo)致的肺疾病與NETs有著密切關(guān)系。

一、NETs與肺炎鏈球菌感染

肺炎鏈球菌是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體。肺炎鏈球菌為革蘭陽性細(xì)菌，其主要致病成分為莢膜、脂磷壁酸和鏈球菌溶素。中性粒細(xì)胞在接觸肺炎球菌時(shí)可釋放NETs，損傷肺組織[7]，Nel[8]等研究表明，肺炎鏈球菌介導(dǎo)的NETs形成依賴于鏈球菌溶素，該機(jī)制獨(dú)立于Toll樣受體4 (TLR4)或ROS。而相反的結(jié)論表明，肺炎鏈球菌刺激后NETs的釋放與鏈球菌溶素?zé)o關(guān)，而與自噬有關(guān)[9]。因此，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)NETs的直接機(jī)制尚不清楚。NETs可使肺炎鏈球菌固定，并限制其在宿主中傳播。肺炎鏈球菌可利用脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)降解NETs，從而進(jìn)行免疫逃逸。研究者利用質(zhì)譜分析證實(shí)TatD是一種潛在的細(xì)胞外DNA酶，可降解NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。TatD的DNase活性有助于肺炎鏈球菌從NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中逃逸。在膿毒癥小鼠模型中，與野生型肺炎鏈球菌感染相比，敲除TatD的鏈球菌感染后，小鼠表現(xiàn)為鏈球菌感染減少，肺組織損害減輕，存活率提高。TatD抑制劑或可避免肺炎鏈球菌發(fā)生NETs相關(guān)的病原逃逸，從而成為治療肺炎球菌肺炎的潛在靶點(diǎn)[10]。在臨床病例研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)社區(qū)獲得性肺炎可導(dǎo)致NETs水平升高，且血清中NETs升高的患者臨床不穩(wěn)定性增加、住院時(shí)間延長。由此預(yù)測NETs是一種新的預(yù)后指標(biāo)，也是社區(qū)獲得性肺炎輔助治療的可能靶點(diǎn)[11]。

二、NETs 與呼吸道合胞病毒感染

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒常見呼吸道感染病毒。中性粒細(xì)胞及其產(chǎn)物存在于RSV感染患兒的呼吸道，將增加其癥狀嚴(yán)重程度[12]。RSV是一種單鏈RNA病毒，其基因組可編碼多達(dá)11種蛋白質(zhì)。其中融合蛋白(F)存在于病毒粒子表面，在病毒進(jìn)入時(shí)介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜融合[13]。有證據(jù)表明，NETs能夠捕獲RSV，從而阻止病毒顆粒與靶細(xì)胞結(jié)合，防止感染。NETs的形成可能是限制RSV病毒擴(kuò)散的重要機(jī)制[14]。但與此同時(shí)，F(xiàn)蛋白以ERK和P38mapk磷酸化依賴的方式誘導(dǎo)NETs生成，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被中性粒細(xì)胞彈性酶和髓過氧化物酶修飾，這些顆粒蛋白可以損傷組織，加重癥狀，損害肺功能[15]。以上結(jié)果表明，RSV 中F蛋白誘導(dǎo)NETs形成在RSV感染中起“雙刃劍”作用。由黏液、中性粒細(xì)胞的細(xì)胞碎片和脫落的支氣管上皮細(xì)胞組成的致密栓子造成小氣道阻塞是RSV下呼吸道疾病(RSV lower respiratory tract disease, RSV-LRTD)患者的主要病理特征[15]。在患有嚴(yán)重RSV-LRTD嬰幼兒的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中，研究者發(fā)現(xiàn)了NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[16]。Cortjens[17]等則進(jìn)一步證實(shí)，在嚴(yán)重RSV-LRTD患者中，NETs的形成促進(jìn)中性粒細(xì)胞耗竭，導(dǎo)致氣道中粘蛋白含量增高，氣道阻塞癥狀加重。對(duì)于嚴(yán)重RSV-LRTD氣道阻塞患者，針對(duì)NETs的靶向藥物是一種新的治療措施。

三、NETs與哮喘

支氣管哮喘(哮喘)(bronchial asthma)為呼吸系統(tǒng)中常見疾病，嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞及多種細(xì)胞組分均參與哮喘病程。重癥哮喘可誘導(dǎo)肺損傷發(fā)生。在哮喘過程中，中性粒細(xì)胞為調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以在氣道中浸潤，釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的功能，從而在哮喘中發(fā)揮重要作用[18]。在仙臺(tái)病毒(SEV)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠哮喘模型中，研究者證實(shí)哮喘患者氣道中性粒細(xì)胞可形成NETs[19]。在嗜中性哮喘患者(痰中中性粒細(xì)胞比例超過嗜酸性粒細(xì)胞比例)血漿中，IL-8、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和NETs均升高[20]。經(jīng)鼻病毒(RV)感染后，過敏小鼠氣道內(nèi)大量中性粒細(xì)胞募集和過量NETs沉積與大量雙鏈DNA(dsDNA)釋放相關(guān)，可促進(jìn)2型免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重哮喘癥狀。經(jīng)dsDNA處理的過敏小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量和百分比均高于對(duì)照組，而小鼠在使用DNase處理后，血清IgE濃度、BALF中黏蛋白5AC(MUC5AC)和氣道炎癥細(xì)胞浸潤的濃度均降低，且呼吸道粘液產(chǎn)生減少，氣道高反應(yīng)得到緩解[21]，提示dsDNA作為NETs的組成成分在哮喘過程中發(fā)揮重要作用，有研究者認(rèn)為，NETs可介導(dǎo)炎癥小體激活與單核細(xì)胞中IL-1分泌,引起氣道上皮細(xì)胞損傷，加哮喘癥狀[22]。Pham[23]等則通過臨床試驗(yàn)證實(shí)，NETs會(huì)造成氣道上皮損害從而加重哮喘癥狀。以上研究說明，NETs在哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。在哮喘治療過程中，糖皮質(zhì)激素發(fā)揮重要作用。有研究者認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素在體外和體內(nèi)都能降低哮喘肺組織中NETs形成，并提出利用重組人DNA酶來消除NETs或?qū)⒊蔀橄囊粋€(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)[24]。

四、NETs與膿毒癥性肺損傷

膿毒癥可造成多種器官損傷，如急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)，損傷嚴(yán)重的急性肺損傷(ALI)可進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，其臨床特征為肺血管通透性增高，肺間質(zhì)及肺泡水腫，從而導(dǎo)致頑固性低氧血癥。研究表明，NETs的產(chǎn)生對(duì)于ALI的進(jìn)展起重要作用。在疾病初期，NETs的形成可捕獲病原體，但隨著NETs的過度形成可造成肺組織損傷，加重疾病癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠膿毒癥性肺損傷模型中，氣管內(nèi)接種聚肌胞苷酸(poly I:C)小鼠的BALF中，中性粒細(xì)胞浸潤明顯增加，同時(shí)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL- 6和TNF-α在肺部也顯著升高，在其肺組織中MPO和Cith3表達(dá)明顯升高，表明NETs形成增多。poly I:C誘導(dǎo)NETs和ALI的形成，與p38 MAPK的激活和claudin-5的表達(dá)降低有關(guān)[25]。研究者在脂多糖(LPS)致死性膿毒癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的PAD的激活以及隨后Cith 3介導(dǎo)NETs的形成增加了內(nèi)皮細(xì)胞的通透性和肺功能障礙,而通過減少PAD的激活，可阻斷LPS誘導(dǎo)的肺血管滲漏，減輕急性肺損傷，提高存活率[26]。通過經(jīng)盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)誘導(dǎo)膿毒癥，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)通過上調(diào)PAD4的表達(dá)誘導(dǎo)肺部NETs形成，從而加重膿毒癥性肺損傷[27]。這些研究提示NETs在膿毒癥性肺損傷中發(fā)揮重要作用。在膿毒性肺損傷小鼠模型中，肝素可與 NETs中帶正電荷的組蛋白相結(jié)合，降低NETs的活性，減弱NETs介導(dǎo)的促凝效應(yīng)，降低NETs對(duì)肺組織的損傷，這一觀點(diǎn)或可為膿毒癥性肺損傷提供治療新思路[28]。

五、NETs與肺癌

肺癌(Lung cancer)是起源于支氣管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤之首，肺癌的早期診斷率低，預(yù)后差，因此肺癌的早期診斷對(duì)改善肺癌的預(yù)后具有重要作用。研究證實(shí)，肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞外RNA(exRNAs)可間接誘導(dǎo)網(wǎng)，并參與肺癌的發(fā)生[29]。Albrengues[30]等人在肺癌休眠期小鼠模型中，利用煙草煙霧或經(jīng)鼻腔注入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)引起的持續(xù)性肺炎癥的同時(shí)，體內(nèi)大量生成NETs。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶9是NETs相關(guān)的蛋白酶，它們都是序列裂解的層粘連蛋白。蛋白水解重組層粘連蛋白通過激活整合素a3b1信號(hào)通路誘導(dǎo)休眠癌細(xì)胞增殖。開發(fā)針對(duì)NETs重構(gòu)層粘連蛋白的抗體可阻止休眠細(xì)胞覺醒，這種防止休眠細(xì)胞覺醒的療法或可延長癌癥患者的生存時(shí)間。在非炎性條件的肺癌模型中，研究者發(fā)現(xiàn)游離巰基是血漿維持氧化還原平衡的關(guān)鍵物質(zhì)，而白蛋白是其主要儲(chǔ)存庫，游離巰基可用來清除循環(huán)中性粒細(xì)胞中的活性氧(ROS)，當(dāng)這種白蛋白巰基庫在癌癥狀態(tài)下耗盡時(shí)，白蛋白氧化導(dǎo)致游離巰基丟失，從而血漿氧化還原失衡，這一過程可使中性粒細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的積累誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生，由此形成的NETs主要存在于肺內(nèi)，它們有助于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的定植，從而導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移[31]。抗NETs療法和將NETs作為潛在的預(yù)測標(biāo)志物或可提供一種有效的臨床策略來對(duì)抗肺癌轉(zhuǎn)移。

展望

自NETs發(fā)現(xiàn)以來，研究者在各類疾病中發(fā)現(xiàn)并研究NETs產(chǎn)生機(jī)制?，F(xiàn)已證實(shí)，產(chǎn)生過多或降解不足的NETs會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷，進(jìn)而加重疾病癥狀。NETs抑制劑則成為治療疾病新的靶點(diǎn)，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，重組DNase已成功應(yīng)用于疾病痰液的液化，此外蛋白酶抑制劑也被應(yīng)用于該疾病[32]。但NETs在各種肺疾病中產(chǎn)生的具體機(jī)制尚不明確，這也為今后的研究提供新的方向。