肌萎縮側(cè)索硬化生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張倩倩，袁寶玉，謝春明

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)又稱盧伽雷氏病，常以肢體和球部起病，主要影響大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞和腦干、脊髓中的運動神經(jīng)元，引起進(jìn)行性的肌無力、肌萎縮、球麻痹，導(dǎo)致患者全身肌肉癱瘓、吸入性肺炎、誤咽和死亡[1-2]。約10%為家族性ALS(fALS)，而大多數(shù)ALS病例是散發(fā)性ALS(sALS)[3]。高達(dá)50%的ALS患者會出現(xiàn)認(rèn)知障礙，而約13%的患者伴有額顳葉癡呆[4]，為家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前ALS的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)或神經(jīng)電生理發(fā)現(xiàn)廣泛上下運動神經(jīng)元損害的證據(jù)，但本病表型存在較大異質(zhì)性，患者發(fā)病至診斷之間會有1年左右的延遲[5]。由于生物標(biāo)志物具備高度的敏感性和特異性，有助于縮短ALS診斷延遲及監(jiān)測疾病進(jìn)展、觀察療效、促進(jìn)藥物研發(fā)等，近年來國內(nèi)外對ALS生物標(biāo)志物進(jìn)行了深入探究并取得了一定的進(jìn)展。本文主要對神經(jīng)生化、神經(jīng)電生理及神經(jīng)影像生物標(biāo)志物與ALS診斷、監(jiān)測及預(yù)后等方面的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)行綜述，闡明ALS生物標(biāo)志物在臨床上潛在的重要作用并探討后續(xù)的研究方向。

1 神經(jīng)生化

1.1 血液和CSF ALS確切的發(fā)病機(jī)制不明，目前認(rèn)為多種機(jī)制可能參與ALS的發(fā)生發(fā)展，如代謝紊亂、氧化應(yīng)激、RNA加工失調(diào)和軸突運輸異常等，并在血液和CSF中發(fā)現(xiàn)眾多潛在的相關(guān)生物標(biāo)志物。

1.1.1 血清肌酸激酶(CK) CK與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，23%～70%的ALS患者血清CK水平輕至中度升高，高水平的CK與ALS患者下運動神經(jīng)元損傷和肌肉去神經(jīng)支配的嚴(yán)重程度有關(guān)[6]，而肢體發(fā)病的ALS患者CK水平顯著高于延髓發(fā)病者[7]。此外，CK水平還存在性別差異，研究發(fā)現(xiàn)男性ALS患者的CK水平顯著高于女性[8]。縱向研究顯示，ALS患者的CK水平與存活時間負(fù)相關(guān)，高水平CK的ALS患者死亡風(fēng)險增加88%[9]。但也有研究指出CK水平的升高與ALS患者的病情進(jìn)展速度及病情嚴(yán)重程度并不平行[10]。

總之，目前的研究一致認(rèn)為ALS中可存在CK水平輕度到中度的升高，這有助于臨床上早期識別ALS，避免被誤診為肌肉病造成不必要的檢查和延誤治療時機(jī)[10]。

1.1.2 尿酸 尿酸是嘌呤代謝的主要終產(chǎn)物。血清尿酸可清除超氧化物，防止超氧化物與NO反應(yīng)形成強氧化劑過氧亞硝酸鹽，而高濃度尿酸可延緩神經(jīng)變性疾病的發(fā)展[11]。與健康對照組相比，ALS患者的血清尿酸水平明顯降低并與疾病進(jìn)展速度負(fù)相關(guān)，與生存時間正相關(guān)[12]。更為重要的是，回歸分析表明血清尿酸與ALS早期的疾病進(jìn)展率ΔFS[ΔFS=(48-檢查時ALS功能評分量表得分)/癥狀發(fā)作與檢查時間之間的持續(xù)時間]存在顯著正相關(guān)，但與ALS晚期缺乏相關(guān)性，提示尿酸水平可作為ALS患者早期進(jìn)展的生物標(biāo)志物[12]。Meta分析表明, ALS患者的血清尿酸水平明顯降低，血清尿酸水平與ALS患者死亡風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[13]。與此不同的是，最近的一項研究雖然發(fā)現(xiàn)ALS組尿酸水平較健康對照組顯著減低，但卻未發(fā)現(xiàn)血清尿酸與疾病嚴(yán)重程度和進(jìn)展速度的關(guān)聯(lián)性[14]。

由此可見，尿酸是ALS的保護(hù)因素并降低ALS死亡風(fēng)險，這有助于臨床醫(yī)師對ALS患者病程中出現(xiàn)尿酸水平異常波動的理解。但尿酸水平是否可以作為臨床監(jiān)測ALS進(jìn)展的生物標(biāo)志物，能否用于臨床評估疾病進(jìn)展速度，是否具有種群特異性仍存在爭議，需要更多的研究去驗證。

1.1.3 微小核糖核酸(miRNA) miRNA是一種非編碼RNA分子。血液中miRNA十分穩(wěn)定，具有高度組織特異性、可量化、易于提取和分析等特點，因此具有成為生物標(biāo)志物的潛力[15]。Takahashi等[16]發(fā)現(xiàn)，sALS多種血漿miRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，sALS患者血漿總RNA水平與疾病的病程呈負(fù)相關(guān)，let-7f-5p的表達(dá)水平與修訂版ALS功能評分量表(ALSFRS-R)的球麻痹分值呈負(fù)相關(guān)。Chen等[17]對83例sALS患者，24例帕金森病患者和61名健康對照者進(jìn)行了11種白細(xì)胞miRNA表達(dá)的檢測后發(fā)現(xiàn)，sALS組中只有hsa-miR-183水平顯著低于帕金森病組和健康對照組，hsa-miR-183可能是sALS的特有生物標(biāo)志物。此外，與健康對照相比，ALS血清miRNA-206和miRNA-143-3p的表達(dá)明顯增加而miRNA-374b-5p的表達(dá)明顯降低，且與是否接受利魯唑治療無關(guān)。血液中miRNA性質(zhì)穩(wěn)定，特異性高，表明miRNA具有作為sALS生物標(biāo)志物的潛力，有助于臨床醫(yī)師對ALS臨床診斷、鑒別診斷和預(yù)后判斷[18]。

1.1.4 神經(jīng)絲(Nf) Nf是軸突骨架的重要組成部分，由3個亞基組成：神經(jīng)絲輕鏈 (NfL)、神經(jīng)絲中鏈、神經(jīng)絲重鏈 (NfH)。研究發(fā)現(xiàn)，CSF、血清或血漿NfL不僅對ALS診斷具有較高的敏感性和特異性，且可量化癥狀前ALS的進(jìn)展[19-20]，而CSF pNfH對ALS檢測的特異性高達(dá)88.2%，是潛在的ALS診斷生物標(biāo)志物[21-22]。研究顯示，無論是CSF還是血液的pNfH和NfL水平均可用于預(yù)測ALS存活率和監(jiān)測疾病進(jìn)展，其中CSF pNfH對ALS診斷的準(zhǔn)確率最高[23]。

雖然諸多可能的生物標(biāo)志物研究仍在進(jìn)行，但目前認(rèn)為Nf是最有希望的生物標(biāo)志物，無論是CSF還是血液的NfL、pNfH對ALS臨床的診斷、疾病監(jiān)測、預(yù)后判斷均具有高敏感性與特異性，在未來臨床應(yīng)用中潛力巨大。

1.2 尿液

1.2.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(p75ECD) 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75是神經(jīng)營養(yǎng)因子的2種受體之一，可介導(dǎo)疾病或創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡。與健康對照相比，ALS患者尿p75ECD水平隨著疾病的快速進(jìn)展和運動功能的下降而明顯升高，但慢性進(jìn)展患者中的p75ECD水平則相對恒定，提示尿p75ECD可以作為判斷ALS快速進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物[24-25]。Jia等[26]研究表明，臨床分期越靠后，尿p75ECD水平越高，而快速進(jìn)展性ALS患者的尿p75ECD水平明顯高于緩慢進(jìn)展者，表明尿p75ECD水平可作為臨床疑似ALS患者的附加診斷依據(jù)，并可用于評估ALS嚴(yán)重程度。

1.2.2 8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OH2′dG) 8OH2′dG是DNA受氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物。先前的研究[27]發(fā)現(xiàn)，ALS 患者血清中8OH2′dG水平明顯高于健康受試者并與ALSFRS呈負(fù)相關(guān)。在尿液中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，ALS患者的尿8OH2′dG水平升高并與ALSFRS-R評分呈負(fù)相關(guān)，尿8OH2′dG具有作為ALS預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[28]。

尿液檢查取材方便、無創(chuàng)，易于在臨床推廣。尿p75ECD和8OH2′dG可作為臨床ALS疾病進(jìn)展監(jiān)測和評估嚴(yán)重程度的重要參考指標(biāo)，有助于指導(dǎo)臨床治療和藥物研發(fā)中觀察藥物療效。

2 神經(jīng)電生理學(xué)

EMG在ALS診斷中具有重要作用，利用針極EMG可發(fā)現(xiàn)活動性失神經(jīng)(纖顫、正銳波和束顫電位)和慢性神經(jīng)再生的證據(jù)[29-30]。EMG中的運動單位數(shù)目估計可作為檢測ALS病情變化的電生理標(biāo)志物[31]，但其操作不方便，耗時較長，近年來逐漸被運動單位數(shù)目指數(shù)(MUNIX)取代。Neuwirth等[32]在為期3個月的EMG測量中發(fā)現(xiàn)，ALS患者的MUNIX平均每月?lián)p失為5.0%，且變化幅度明顯強于CMAP，表明MUNIX對發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元的丟失具有更高的敏感性，并且可作為監(jiān)測ALS發(fā)展的可靠指標(biāo)。同時，MUNIX還被證實是評估ALS患者顱內(nèi)段神經(jīng)功能的有效指標(biāo)[33]。另一個受關(guān)注的是神經(jīng)生理指數(shù)(NI)，NI可綜合反映周圍神經(jīng)近端和遠(yuǎn)端的功能，計算式為NI=(CMAP波幅/遠(yuǎn)端運動潛伏期) × F波出現(xiàn)率，研究[34]顯示，正中神經(jīng)NI和尺神經(jīng)NI與ΔFS均呈負(fù)相關(guān)，NI記錄的下降速度比常規(guī)的疾病進(jìn)展臨床指標(biāo)更敏感，可用于ALS預(yù)后的評估。Escorcio-Bezerra等[35]發(fā)現(xiàn)平均MUNIX和NI在慢性進(jìn)展型ALS患者早期即可有顯著下降，NI和MUNIX異常可以做為ALS早期評估手段。除此之外，電阻抗成像(EIM)通過測量局部組織阻抗提供肌肉健康的定量數(shù)據(jù)，被認(rèn)為是ALS進(jìn)展的生物標(biāo)志物，而100 kHz可以作為測量ALS EIM相位值的最佳頻率[36]。Shellikeri等[37]發(fā)現(xiàn),與健康對照相比，ALS患者的舌肌相位值小，電阻大，可用來區(qū)分ALS與健康對照，舌肌EIM可作為ALS潛在生物標(biāo)志物。

中國ALS診斷和治療指南指出，當(dāng)臨床考慮為ALS時需要進(jìn)行神經(jīng)電生理檢查，以確認(rèn)臨床受累區(qū)域為下運動神經(jīng)元病變，并發(fā)現(xiàn)在臨床未受累區(qū)域也存在下運動神經(jīng)元病變，同時排除其他疾病[38]。神經(jīng)電生理檢查是臨床體檢的延伸，對于臨床早期識別ALS患者及監(jiān)測疾病發(fā)展具有高敏感性和特異性，臨床醫(yī)師應(yīng)加以重視并熟練掌握。

3 神經(jīng)影像

隨著神經(jīng)影像的飛速發(fā)展，尤其是PET、MRI等多模態(tài)影像的應(yīng)用極大的拓展了對ALS生物標(biāo)志物的探索。一項最近的DTI研究顯示，與健康對照相比，ALS患者表現(xiàn)為皮質(zhì)脊髓束(CST)和胼胝體的徑向擴(kuò)散率(RD)、平均擴(kuò)散率(MD)的增加和分?jǐn)?shù)各向異性(FA)的減少。其中左側(cè)CST的FA值越高，ALSFRS-R評分越高，而RD值與ALSFRS-R評分呈明顯負(fù)相關(guān)，提示RD和FA均可作為疾病嚴(yán)重程度評估的影像生物標(biāo)志物，而CST可能是ALS受影響最大的腦白質(zhì)纖維[39]。靜息態(tài)功能性MRI(rs-fMRI)可通過血流和血氧水平依賴性對比的技術(shù)檢測早期腦功能活動的細(xì)微改變。最近Bueno等[40]通過rs-fMRI對比了20例ALS患者和11名健康對照者的分?jǐn)?shù)低頻振幅(fALFF)和局部一致性(ReHo)，結(jié)果顯示ALS患者局部腦區(qū)的fALFF和ReHo值較健康對照者顯著降低且與疾病持續(xù)時間負(fù)相關(guān)，是ALS嚴(yán)重程度和進(jìn)展的潛在影像生物標(biāo)志物。近年來高場強MRI也成為探索ALS神經(jīng)影像生物標(biāo)志物的重要工具。Cosottini等[41]通過使用7 T MRI對22例ALS患者和14名健康受試者的運動皮質(zhì)掃描顯示，ALS患者初級運動皮質(zhì)深層厚度減少并伴有信號降低，可能是ALS患者上運動神經(jīng)元損傷的標(biāo)志。

肌肉超聲可檢測肌肉的厚度和回聲變化，提供肌肉去神經(jīng)支配的補充證據(jù)。有報道指出肌肉超聲檢測肌束震顫比EMG更為敏感[42]，并在ALS患者中檢測出顯著的肌肉厚度下降和回聲強度的增加[43]。其中，拇短展肌的肌肉厚度和回聲強度的聯(lián)合是ALS診斷和進(jìn)展監(jiān)測的可靠生物標(biāo)志物[44]。

此外，通過使用18F-2-氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG) PET還發(fā)現(xiàn)ALS在前額皮質(zhì)和前運動皮質(zhì)的代謝減退及小腦、腦干上部和顳葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)的代謝亢進(jìn)，這表明18F-FDG PET同樣具有早期區(qū)分ALS與健康對照的潛力[45]。

總之，神經(jīng)影像如MRI早先僅用于ALS的鑒別診斷以除外其他疾病，而如今多模態(tài)MRI的廣泛應(yīng)用已成為ALS生物標(biāo)志物重要的探索工具?；谏窠?jīng)影像發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、功能和代謝等的異常不僅可以作為臨床診斷及監(jiān)測ALS進(jìn)展、評價治療效果的重要參考，也有助于臨床醫(yī)師及時識別病情變化并評估干預(yù)的療效。

4 結(jié)論

隨著不斷地深入研究，未來會涌現(xiàn)出越來越多的有潛力的ALS生物標(biāo)志物，雖然目前尚未出現(xiàn)普遍認(rèn)可的可應(yīng)用于臨床的ALS生物標(biāo)志物，但多種技術(shù)方法的應(yīng)用，如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、多重免疫和多模態(tài)影像等，同時聯(lián)合多個潛在生物標(biāo)志物以提高敏感性與特異性將是下一階段研究的重點。除此之外，開發(fā)更多廉價、方便獲取、依從性高的生物標(biāo)志物，如取材于血液、尿液、唾液等將會降低樣本收集的難度，為深入研究減少阻礙。ALS生物標(biāo)志物的研究不僅有利于探索ALS的發(fā)病機(jī)制，而且有利于臨床診斷和病情監(jiān)測，所以臨床醫(yī)師也應(yīng)多重視相關(guān)的研究進(jìn)展，以便在臨床工作中更加準(zhǔn)確的把握疾病特征，提高診斷的準(zhǔn)確性并及時給出有效的干預(yù)。