植物含跨膜域RING E3泛素連接酶研究進展

孫林靜 張融雪 蘇京平 王勝軍 佟 卉 劉燕清 孫 玥

(天津市農(nóng)作物研究所，天津 300384)

泛素蛋白酶途徑在真核生物中是非常保守的，這個途徑由泛素活化酶E1 (ubiquitin activating enzyme) 、泛素結合酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme) 和泛素連接酶E3 (ubiquitin ligase enzyme) 協(xié)同工作。E1通過ATP依賴的方式與泛素共價結合，E2接受E1提供的泛素并與E3互作，E3識別并結合底物蛋白，然后將泛素轉移給底物蛋白，形成底物蛋白單泛素或者多泛素化[1]。

1 TMD-RING在植物生理過程中的作用

1.1 TMD-RING在非生物脅迫中的作用

AtATL78表達受低溫誘導但受干旱抑制，是一個膜定位RING泛素連接酶，刪除其跨膜域后定位于細胞質，具有體外泛素連接酶活性，AtATL78 RNAi植株對低溫的耐受性增強，但是對干旱的耐受性減弱[2]。

GhSARP1 是一個定位于質膜的C3H2C3類型的E3泛素連接酶，具有體外E3連接酶活性。GhSARP1在花后24、27和27DPA的葉片、花和纖維中轉錄水平較高，在根和莖中轉錄水平較低。GhSARP1的表達被鹽、低溫和ABA下調。過表達GhSARP1的轉基因擬南芥在萌發(fā)和萌發(fā)后階段對鹽脅迫敏感，這表明GhSARP1可能負調控棉花中泛素化介導的鹽脅迫反應[3]。

BnTR1是N末端具有2個跨膜域的C4HC3蛋白，具有體外泛素連接酶活性。在油菜和水稻中過表達該基因，增強了轉基因植株對熱脅迫的抗性。BnTR1可能通過調節(jié)鈣通道的活性參與調控鈣離子動態(tài)，進而誘導熱擊轉錄因子和熱擊蛋白表達量上調，從而正調控植物熱脅迫耐受性[4]。

OsHIR1是定位于質膜和細胞核的C3H2C3類型RING泛素連接酶，其表達受到砷和鎘誘導。在擬南芥中過表達OsHIR1能增強轉基因植株對砷和鎘的耐受性，OsHIR1能與OsTIP4;1相互作用，并通過26S蛋白酶體介導其降解，減少轉基因植株對砷和鎘的吸收從而增強對重金屬耐受性[5]。

AtSTRF1是定位于質膜和細胞內小體的RING蛋白，受鹽脅迫誘導表達。該基因的缺失突變體幼苗根部的內吞加速，膜轉運系統(tǒng)相關基因表達量改變，對鹽、離子和滲透脅迫耐受性增強，在鹽脅迫下的活性氧積累減少。蛋白轉運抑制劑BFA(brefeldin A)處理突變體后，BFA小體數(shù)目增加，結果表明AtSTRF1是一個膜轉運相關泛素連接酶，能夠調節(jié)鹽脅迫下內膜蛋白轉運和活性氧的產(chǎn)生[6]。

AtCHYR1含有1個CHY鋅指蛋白結構域和1個RING結構域，定位于細胞質、細胞核和內質網(wǎng)。AtCHYR1受ABA和干旱誘導表達，主要表達在維管束和氣孔中。AtCHYR1促進ABA誘導的氣孔關閉和活性氧產(chǎn)生，增強植物耐旱性。SnRK2.6能夠磷酸化AtCHYR1的178位蘇氨酸，該磷酸化位點的破壞能導致AtCHYR1功能喪失[7]。PeCHYR1是AtCHYR1的同源基因，定位于細胞核和內質網(wǎng)，也受ABA和干旱誘導表達。過表達PeCHYR1的轉基因楊樹H2O2產(chǎn)生顯著增強，氣孔孔徑減小。與野生型對照相比，轉基因株系對外源ABA表現(xiàn)出更高的敏感性。此外，PeCHYR1的上調促進了氣孔的閉合，減少了蒸騰作用，使得水分利用效率顯著提高，并維持較高的光合活性和生物量積累。這些結果表明，PeCHYR1通過ABA誘導H2O2的產(chǎn)生導致氣孔關閉，在提高抗旱性方面起著至關重要的作用[8]。

AtSPL1含有2個跨膜域和1個C3HC4類型RING結構域，定位于線粒體和過氧化物酶體，該基因突變體導致過氧化物酶體β氧化活性下降，SPL1降低了SP1誘導PEX13的翻轉能力[9]。

MfSTMIR含有1個跨膜域和1個C3H2C3類型RING結構域，定位于內質網(wǎng)。MfSTMIR表達受鹽、干旱和衣霉素誘導表達。在擬南芥和苜蓿中過表達MfSTMIR均能增強轉基因植株的鹽脅迫耐受性，內質網(wǎng)脅迫相關分子伴侶BiP1/2和BiP3的表達量在過表達植株中上調表達。進一步研究表明，在過表達MfSTMIR的截形苜蓿中，MfSTMIR能與內質網(wǎng)定位的泛素結合酶MtUBC32以及內質網(wǎng)蛋白轉運通道亞基MtSec61γ相互作用，并且不影響互作蛋白的穩(wěn)定性。在煙草瞬時表達系統(tǒng)中，MfSTMIR能夠促進ERAD相關底物MtCPY*的降解。上述結果表明MfSTMIR可能通過與MtUBC32和MtSec61γ相互作用，以ERAD方式清除內質網(wǎng)錯誤折疊蛋白來緩解鹽脅迫對植物的損害[10]。

AtXBAT35.2是定位于高爾基體的RING蛋白，該基因功能缺失增強了對鹽和干旱脅迫的耐受性，而過表達增加了敏感性，這與XBAT35.2介導ACD11的蛋白酶體依賴降解一致。這表明在非生物脅迫下，ACD11高表達能增強植物耐性，當XBAT35.2積累進而促進ACD11的降解，從而降低了脅迫耐受性[11]。

1.2 TMD-RING在植物激素信號通路中的作用

XERICO (Greek for drought tolerant ) 是一個含有N末端跨膜的RING-H2類型泛素連接酶，過表達XERICO擬南芥抗旱性增強但是對高鹽和滲透脅迫敏感；ABA合成途徑關鍵酶NCED3表達量上調，ABA合成量增加，ABA響應基因顯著上調表達。XERICO能與AtUBC8和AtTLP9 (TUBBY-like protein 9) 相互作用，AtTLP9是多亞基RING泛素連接酶的底物識別因子F-box，可能將XERICO作為底物蛋白識別，還有可能是被XERICO作為底物識別，這些有待進一步研究證明[12]。

以上非生物脅迫相關的SDIR1、AIRP1、AIRP3、RHA2a和RHA2b均參與了ABA信號途徑。AtRSL1 (RING finger of seed longevity 1) 是質膜定位的C5HC2類型的RING泛素連接酶，C末端含有一個跨膜域，能與ABA受體PYL4和PYR1在質膜上相互作用并促進這兩個受體的降解。過表達RSL1植株對ABA不敏感，而RSL1的RNAi植株對ABA超敏感，轉基因植株對ABA的響應也發(fā)生了改變[13]。

XBAT35在植物中是ABA反應的正調節(jié)因子，通過VPS23A/PYL4復合物發(fā)揮作用，特別是通過加速VPS23A的周轉，從而增加ABA受體PYL4的積累[14]。

1.3 TMD-RING在植物防御反應中的作用

擬南芥RING1具有多個跨膜域，定位于質膜脂筏。正常條件下RING1表達量在各個組織中比較低，當病原菌侵染或者PCD誘導劑FB1 (Fumonisin B1) 處理能夠誘導該基因表達，利用RNAi技術降低該基因表達可以導致轉基因植株對FB1超敏感[15]。

擬南芥ATL9是一個內質網(wǎng)定位的RING泛素連接酶，植物防御反應相關激素如水楊酸和茉莉酸不能誘導該基因表達，但是幾丁質可以誘導，并且這種誘導依賴NADPH氧化酶。對atl9突變體轉錄組進行分析，結果顯示幾丁質信號途徑和幾丁質誘導的防御反應相關基因可能是ATL9的下游基因，ATL9可能參與了內質網(wǎng)脅迫相關降解過程[16]。

辣椒中的CaRING1受無毒性的野油菜黃單胞菌誘導表達，含有一個N末端跨膜域和C末端RING finger，定位于質膜并具有泛素連接酶活性。病毒誘導CaRING1沉默并使植物超敏反應受損，增加植物對辣椒瘡痂病菌的感染，在擬南芥中過表達CaRING1可增強植株對丁香假單胞菌番茄致病變種的抗性[17]。

AtXBAT35.2是定位于高爾基體的RING蛋白，參與細胞死亡誘導和病原體反應。研究發(fā)現(xiàn)，在煙草葉片中過表達XBAT35.2，會觸發(fā)細胞死亡，而且這種方式需要其RING結構域。XBAT35缺失突變破壞了植物抵御病原體攻擊的能力，而XBAT35.2基因的過表達增強了植物對病原體的抵抗力。XBAT35.2能夠自身降解，接種丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000的毒株和無毒株后，則阻止這種降解。XBAT35.2在植物中與防御相關的ACD11相互作用，并促進其降解，用蛋白酶體抑制劑處理轉基因幼苗會導致ACD11的積累，這表明XBAT35.2在誘導細胞死亡和防御病原體方面起作用[18]。

1.4 TMD-RING在植物養(yǎng)分代謝和轉運中的作用

AtATL31定位于質膜，在植物碳氮代謝平衡和感知方面起作用。過表達ATL31的轉基因植株在碳氮平衡失調時仍然能夠正常萌發(fā)并生長。ATL31能與14-3-3χ相互作用并使之泛素化降解， 14-3-3χ的缺失突變體與過表達ATL31類似，這表明ATL31通過調控14-3-3χ蛋白積累量參與植物碳氮代謝感知[19]。

AtSIS3是含有3個跨膜域的C3H2C3類型RING泛素連接酶，具有體外泛素連接酶活性，sis3在外源添加高濃度葡萄糖時仍然能夠萌發(fā)，但是對外源ABA的響應與野生型類似。這表明SIS3僅在葡萄糖信號通路中起作用，不參與ABA信號轉導[20]。

AtATL15是一個N末端具有跨膜域的RING泛素連接酶，能夠影響擬南芥對蔗糖的信號響應。蔗糖誘導ATL15的下調表達，ATL15定位于質膜和內膜系統(tǒng)。進一步的遺傳分析表明,atl15敲除突變體對高蔗糖濃度不敏感, 而ATL15過表達抑制植物生長。此外, 內源性葡萄糖和淀粉量在atl15敲除突變體和ATL15過表達植株中均受到影響[21]。

AtLOG2 (Loss of GDU2) 主要定位于質膜，能與同樣定位于質膜的GDU1 (Glutamine dumper1) 相互作用，并且二者的組織表達都位于木質部和韌皮組織，AtLOG2通過與GDU1的相互作用調控了植物細胞氨基酸的外向轉運[22]。

OsNLA1是定位于質膜的RING類型泛素連接酶，能夠介導磷轉運蛋白OsPT2/PT8的降解，OsNLA1的突變體導致葉片磷濃度增加，并且是非氮素依賴型的。OsNLA1與泛素結合酶PHO2沒有相互作用，PHO2不是OsNLA1介導OsPT2/PT8的E2[23]。

2 結論與展望

目前對膜定位的泛素連接酶有一些研究報道，但對比預測膜定位的泛素連接酶數(shù)量，已知功能的基因還是相對較少的，對此在今后的研究中需要關注以下幾個方面的研究。首先是TMD-RING E3泛素連接酶底物的鑒定，相比核定位蛋白，膜蛋白的互作蛋白更難以篩選，可以通過去除跨膜域或者利用分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)進行底物篩選鑒定，并且通過雙分子熒光互補、免疫共沉淀等實驗進一步驗證篩選到的互作蛋白的真實性。第二方面是葉綠體及線粒體等細胞器膜定位的TMD-RING E3泛素連接酶的報道較少，對于此類亞細胞定位的E3泛素連接酶的功能應予以關注。第三方面，對于TMD-RING E3泛素連接酶在干旱、鹽、低溫等非生物脅迫下或者是病菌侵染條件下，亞細胞定位是否發(fā)生改變也應當予以關注，因為定位的改變直接影響功能。第四方面，TMD-RING E3泛素連接酶在非生物脅迫方面的功能研究較多，而其他功能方面研究也應當予以關注。細胞膜對細胞的生理過程具有重要作用，應當對含有跨膜域的RING E3泛素連接酶進行更多的研究，以揭示其功能，了解更多的作用條件模式，以豐富對細胞生化過程的調節(jié)認知。