TLR4在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的研究進(jìn)展

王燕燕 吳 瑾

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 上海市小兒消化與營養(yǎng)重點實驗室（上海 200092）

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒期最常見的胃腸道急癥，在疾病早期通常沒有明顯的臨床癥狀，且發(fā)病機制尚未完全明確，導(dǎo)致其在早產(chǎn)兒中具有較高的患病率和死亡率，因此對NEC 的具體發(fā)病機制進(jìn)行深入探索具有重要的臨床意義。目前研究表明，先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)異常都可能與NEC 發(fā)生相關(guān)。模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）是固有免疫系統(tǒng)中的重要成分，PRR 作為一種保守受體，可以識別感染和損傷過程中釋放的致病因子和內(nèi)源性分子，并激活免疫應(yīng)答[1-3]。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一類典型的模式識別受體，可以直接識別并結(jié)合病原體相關(guān)分子模式，引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，在機體的天然免疫防御中發(fā)揮著重要的作用[4]。TLR4是TLRs家族中識別病原微生物的重要成員，是介導(dǎo)革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）應(yīng)答的最主要受體，TLR4廣泛分布于多種細(xì)胞中，腸上皮細(xì)胞和固有層免疫細(xì)胞表面表達(dá)的TLR4被認(rèn)為是NEC炎癥反應(yīng)鏈的起始點和重要調(diào)控點[5]。本文將從TLR 4誘導(dǎo)腸道細(xì)胞凋亡、抑制杯狀細(xì)胞分化及導(dǎo)致腸黏膜內(nèi)淋巴細(xì)胞失衡等方面作一介紹，總結(jié)關(guān)于TLR4表達(dá)異常在NEC發(fā)病過程中所起作用的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 在NEC發(fā)病過程中的表達(dá)變化及其作用

TLRs是固有免疫應(yīng)答中的一種模式識別受體，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有10個，小鼠中有13個。TLRs廣泛表達(dá)于多核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中，并分布于質(zhì)膜表面或內(nèi)體中[4]。TLR4是第一個在哺乳動物的天然免疫細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的TLRs[6]。研究表明，腸上皮細(xì)胞和固有層免疫細(xì)胞中的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；罨cNEC的發(fā)生密切相關(guān)[1]。在早產(chǎn)兒的不成熟腸道中，TLR4表達(dá)顯著升高，導(dǎo)致細(xì)菌定植時腸道對應(yīng)激源產(chǎn)生過度活躍的反應(yīng)[7]，并引起腸上皮細(xì)胞凋亡增加、增殖和遷移減少，最終導(dǎo)致腸上皮的破壞[5,8]。同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，通過一氧化氮合酶的減少導(dǎo)致一氧化氮（nitric oxide，NO）合成減少，引起血流障礙和腸缺血[9]。與野生型小鼠相比，在TLR4變異小鼠中誘導(dǎo)的 NEC嚴(yán)重程度顯著降低，而暴露于脂多糖和缺氧則會導(dǎo)致小鼠腸上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)增加，TLR4信號激活導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡增加，從而加重NEC的腸道損 傷[10]。

2 介導(dǎo)的炎癥-凋亡信號通路在NEC 發(fā)病機制中的作用

2.1 TLR4-MyD88/TRIF信號通路的作用

在NEC病程中，由于腸上皮細(xì)胞凋亡異常而導(dǎo)致的腸道菌群移位是導(dǎo)致感染及致死的主要原因。革蘭氏陰性桿菌是腸道菌群移位的主要細(xì)菌，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，其胞壁外膜的主要成分LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過TLR4進(jìn)行。TLR4與配體LPS結(jié)合后，可引起下游核因子NF-κB（nuclear factor-κb，NF-κb）活化，導(dǎo)致下游多種炎癥因子釋放，同時還可以誘導(dǎo)凋亡[11]。NEC 發(fā)生時腸道細(xì)胞凋亡增加，腸道凋亡率與腸道組織損傷程度呈正相關(guān)[12]。TLR4通過下游的兩條信號通路促發(fā)炎癥和細(xì)胞凋亡，一條通過髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）介導(dǎo)，另一條通路是TRIF（TIR domain containing adaptor inducing interferon β，TRIF）依賴性信號通路，也被稱為MyD88非依賴信號通路[13]。

MyD88是TLR4信號通路下游第一個銜接蛋白，其通過激活下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）及IL-1β等促炎因子，從而促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的凋亡。在MyD88基因敲除小鼠中用LPS誘導(dǎo)NEC，與野生型小鼠NEC相比，其腸道炎癥程度減輕，腸道細(xì)胞凋亡率降低，提示MyD88是NEC炎癥發(fā)生過程中的重要調(diào)控因子之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，乳脂球膜可以通過抑制TLR4信號通路中的TLR 4、MyD 88 蛋白表達(dá)及NF-κB 磷酸化水平，減輕NEC的腸道炎癥反應(yīng)，對新生大鼠的NEC具有良好的治療作用，提示MyD 88 可能是治療NEC的潛在有效靶點[14]。在NEC發(fā)生發(fā)展過程中，TLR4也可以通過TRIF依賴性信號通路激活NF-κB，誘導(dǎo)腸道炎癥和細(xì)胞凋亡[15]。

此外，MyD 88 非依賴信號通路和TRIF 信號通路之間可能存在相互作用。與野生型NEC 小鼠相比，MyD 88基因敲除的NEC 小鼠中TRIF 通路上的主要傳導(dǎo)基因TRIF及IRF-3mRNA 的表達(dá)上調(diào)，提示 MyD88依賴性信號通路可能會影響TRIF通路的激活[12]。還有研究顯示，MyD 88通過下調(diào)TLR 3/TRIF誘導(dǎo)的角膜炎癥發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，提示MyD 88 依賴性信號通路對TIRF依賴性信號通路具有一定的抑制作用[16]。在NEC 發(fā)生過程中MyD 88基因敲除小鼠，TRIF依賴性信號通路可能代償性激活，但其具體機制有待于進(jìn)一步探索研究。

2.2 對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控

在NEC發(fā)病機制中，caspase家族及Bcl-2家族蛋白參與TLR4對腸道細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，cysteinyl aspartate specific proteinase）是一組促使細(xì)胞凋亡的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位，caspase3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行過程中的關(guān)鍵分子，可被casepase8、casepase9等活化，分別激活死亡受體依賴性的外源 性細(xì)胞凋亡途徑和由線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)源性凋亡途徑[17]。在哺乳動物細(xì)胞凋亡過程中，TLR 4 信號通路可以通過caspase8或caspase9激活caspase3，從而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡[18]。研究表明，MyD 88基因缺失型小鼠的caspase 3、cCaspase 8 和caspase 9 表達(dá)均較野生型小鼠降低，說明MyD 88 可能同時參與了caspase 8、caspase9介導(dǎo)的外源性和內(nèi)源性凋亡途徑[12]。

Bcl-2家族蛋白是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的另一組蛋白，其家族成員包括促凋亡蛋白（Bax、Bad、Bak和Bok 等）和抗凋亡蛋白（包括Bcl-2 自身，Bcl-xl 和Bcl-w等），促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡對于腸道細(xì)胞的生存至關(guān)重要[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在TLR 4基因敲除小鼠中誘導(dǎo)NEC，Bax的表達(dá)保持不變，Bcl-2的表達(dá)顯著增加；而在野生型小鼠中誘導(dǎo)NEC，Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)保持穩(wěn)定，提示TLR4也通過影響促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl的表達(dá)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡[18]。

3 通過 Notch信號通路抑制杯狀細(xì)胞分化

Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Notch受體、Notch配體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子三部分組成，在發(fā)育與細(xì)胞成熟的過程中調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖與分化[20]。小腸上皮祖細(xì)胞的分化能力由Notch信號通路的活性決定，Notch信號通路活化可抑制杯狀細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，NEC腸道組織的TLR4及Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)量增加，杯狀細(xì)胞及其分泌的黏蛋白2顯著降低；在TLR4敲除NEC小鼠中，Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)受抑制，杯狀細(xì)胞增加，NEC嚴(yán)重性降低[21]。這提示在NEC發(fā)病過程中，TLR4可能通過激活Notch信號通路抑制杯狀細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRIF缺陷小鼠回腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且Notch信號的激活減少，提示腸上皮細(xì)胞中的TLR4可能通過TRIF通路激活Notch信號通路，抑制腸上皮細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞，導(dǎo)致腸道黏蛋白2分泌減少，腸道防御屏障損傷，從而導(dǎo)致NEC的發(fā)生[21]。

4 過度激活導(dǎo)致腸黏膜內(nèi)淋巴細(xì)胞失衡

腸黏膜組織中T淋巴細(xì)胞的募集是由淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的趨化因子受體9（C-C motif chemokine receptor 9，CCR 9）和腸上皮細(xì)胞分泌的同源趨化因子配體25（C-C motif chemokine ligand 25，CCL25）控制。TLR4激活可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞CCL25表達(dá)，引起淋巴細(xì)胞浸潤，這與NEC腸道炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[22]。促炎性輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）和抗炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）之間的平衡失調(diào)在新生兒腸道損傷中起著關(guān)鍵作用，在小鼠和人NEC的發(fā)病過程中，CD4+Th17淋巴細(xì)胞浸潤尤為顯著，這是導(dǎo)致NEC發(fā)生發(fā)展的重要因素。

研究發(fā)現(xiàn)，與足月兒相比，在早產(chǎn)兒腸道中，促進(jìn)T 細(xì)胞向Th 17 分化的關(guān)鍵因子，如IL-22、IL-6 及磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，pSTAT3）的表達(dá)增加。與此相一致，NEC 小鼠IL-22、IL-6、pSTAT3的表達(dá)也明顯升高，并且呈現(xiàn)TLR4依賴性，因為在腸上皮細(xì)胞條件性敲除TLR4基因的小鼠中誘導(dǎo)NEC，上述因子的表達(dá)升高被阻斷[5]。此外，在誘導(dǎo)小鼠NEC 之前給予STAT 3 抑制劑，NEC 的嚴(yán)重程度顯著降低，提示腸上皮細(xì)胞表達(dá)的TLR4可能通過促進(jìn)IL-22、IL-6及pSTAT3等促炎因子的生成，引起腸黏膜固有層中Th17細(xì)胞分化，Th17細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-17損害腸上皮緊密連接、參與NEC的腸道炎癥[5]。

此外，NEC 患兒腸黏膜固有層中單核細(xì)胞表面TLR 4 表達(dá)升高，TLR 4 可通過Myd 88 信號通路促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞的激活，釋放IL-1、IL-6、IL-12 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）等多種促炎因子，同樣促進(jìn)固有層中Th 17 細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th17/ Treg失衡，誘導(dǎo)NEC的腸道炎癥發(fā)生[23]。因此，由于TLR4的高表達(dá)使得NEC患者腸道微環(huán)境促炎性Th17淋巴細(xì)胞分化募集，從而促進(jìn)NEC的發(fā)生發(fā)展。

5 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

5.1 TLR9

TLR9是一種細(xì)菌DNA受體，研究表明，TLR4和TLR 9 在NEC 患兒和動物模型中的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢，在NEC 患兒的腸上皮細(xì)胞中，TLR 4 表達(dá)增加而TLR9表達(dá)減少[24]。另有研究顯示，益生菌可以通過激活TLR9和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization-2，NOD2），從而抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻止NEC發(fā)展[10]。提示TLR9與配體結(jié)合后可能影響TLR4信號通路，抑制NF-κB的激活，從而減少腸道細(xì)胞的凋亡和細(xì)菌移位、減輕NEC的腸道損傷。

5.2 胰島素樣生長因子-1

胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor，IGF-1）是存在于母乳中的具有促生長作用的多肽類物質(zhì)。研究表明，IGF-1 可改善新生NEC 大鼠模型的臨床癥狀，降低發(fā)生率，其可能機制是IGF-1 下調(diào)TLR 4 表達(dá)，抑制炎癥逆質(zhì)的產(chǎn)生，上調(diào)MUC 2和sIgA 的表達(dá)，從而保護腸黏膜的機械和免疫屏障功能[25]。提示在早產(chǎn)兒配方奶粉中添加生理濃度的IGF-1可以預(yù)防或延緩NEC的發(fā)生，為NEC的防治提供了新思路。

5.3 IL-1相關(guān)受體和Toll作用蛋白

I L-1 相關(guān)受體（single Ig IL-1-related receptor,SIGIRR）和Toll作用蛋白（Toll interacting protein,Tollip）是TLR4信號通路中兩個重要的負(fù)調(diào)控因子，可以通過抑制IL-1受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor associated kinase，IRAK）磷酸化而減少TLR 4 信號下傳，減輕炎癥反應(yīng)[26-27]。研究表明，大鼠不成熟腸道組織中TLR4表達(dá)上調(diào)，而TLR4信號負(fù)性調(diào)節(jié)因子SIGIRR和Tollip 表達(dá)下調(diào)，提示不成熟腸道組織容易出現(xiàn)炎癥性壞死，不僅與TLR4過度表達(dá)有關(guān)，還與SIGIRR和Tollip的下調(diào)密切相關(guān)[28]，但TLR 4 負(fù)調(diào)控因子在NEC 的炎癥抑制效果及具體作用機制還需要進(jìn)一步探索研究。

6 結(jié)語

早產(chǎn)兒腸道中高表達(dá)的TLR4會通過介導(dǎo)腸道細(xì)胞凋亡、抑制杯狀細(xì)胞分化及誘導(dǎo)腸道Treg/Th 17 細(xì)胞失衡等途徑造成腸黏膜屏障損傷，從而導(dǎo)致NEC的發(fā)生。通過抑制TLR4信號通路及其下游靶點可降低NEC的嚴(yán)重程度，并有望成為治療或阻止NEC發(fā)展的潛在治療方法。