蜜蜂微孢子蟲提取與純化方法

熊 亮，汪 燕，彭青春，馬振剛

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 沙坪壩401331）

蜜蜂微孢子蟲是一種真核微生物，可引起蜜蜂患蜜蜂微粒子病。患蜜蜂微粒子病的中腸嚴重受損，出現(xiàn)爬蜂、下痢等癥狀，最終導(dǎo)致蜜蜂群勢減弱，產(chǎn)蜜量降低，對養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前微粒子病在蜂群中的傳播已經(jīng)非常廣泛，對蜜蜂微孢子蟲的防治研究是蜜蜂病蟲害研究的重點之一。但是從事蜜蜂微孢子蟲研究的前提就是獲得大量純化的蜜蜂微孢子蟲作為研究材料，因此尋找有效的蜜蜂微孢子蟲提取純化方法顯得尤為重要。目前已報道的基本都是根據(jù)蔗糖密度梯度離心法、Percoll密度梯度離心法、差速離心法等方法來分離純化微孢子蟲。蜜蜂微孢子蟲呈橢圓形與其他物種微孢子蟲大小不一樣，已報道的方法用于提取蜜蜂微孢子蟲會造成大量孢子損失，因此在其基礎(chǔ)上需要不斷地進行操作優(yōu)化，以收獲純凈的蜜蜂微孢子蟲。下面介紹一種在常規(guī)離心條件下可有效純化蜜蜂微孢子蟲的方法，可供廣大蜂業(yè)科研工作者參考。

1 從勻漿液中分離蜜蜂微孢子蟲

首先，收集患微粒子病的蜜蜂，取腹部。用勻漿器或研缽研磨成勻漿，勻漿加dd H2O后用4層紗布過濾，去掉濾渣，收集濾液；濾液經(jīng)3 000 r/min離心5 min，留沉淀；用dd H2O將沉淀重新懸浮后再經(jīng)3 000 r/min，5 min離心，收集沉淀；隨后，再用dd H2O懸浮上述沉淀，300 r/min離心5 min，收集上清液；同時，用dd H2O將沉淀懸浮起來，300 r/min離心5 min，重復(fù)此步驟多次，直至上清液幾乎無微孢子蟲為止。最后，將上述離心收集的上清液于3 000 r/min離心5 min后，收集沉淀，并重懸于生理鹽水中，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2 蜜蜂微孢子蟲的純化

Percoll原液用1.5 M的NaCl稀釋為濃度25 %、50 %、75 %和100 %，做成管底到管口的濃度不斷降低的不連續(xù)梯度，加入未純化的蜜蜂微孢子蟲，4℃,12 000 rpm超速離心20 min后，有白色沉淀沉積于離心管管底。去掉上清液，收集白色沉淀。白色沉淀用PBS溶液懸浮，放入1.5 mL的離心管中，3 000 r/min離心5 min。去掉上清液，刮掉沉淀上面的黑色部分，加入少量PBS溶液，吹打白色沉淀，直到底部出現(xiàn)黑色沉淀，收集已懸浮的液體，3 000 r/min離心5 min，即可得到較純的蜜蜂微孢子蟲沉淀。經(jīng)鏡檢，微孢子蟲均一性和折光性一致，可進行后續(xù)基因組提取、蛋白提取等實驗。此方法的優(yōu)點是操作簡單，所需試劑和設(shè)備常見，能得到大量較純的蜜蜂微孢子蟲用于后續(xù)研究。