組織工程與修復重建技術(shù)在小兒外科的應(yīng)用進展

趙衛(wèi)華 朱光輝

美國學者Vacanti和Langer于1993年提出組織工程學(tissue engineering)這一概念，給修復重建外科的發(fā)展帶來了新的機遇[1]。之后二十余年，眾多學者探索利用組織工程學方法修復組織缺損、重建結(jié)構(gòu)和功能，效果良好。組織工程學基于對正常組織和病理組織中結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解，是一門融合工程學和生命科學原理，研發(fā)能夠恢復或改善組織、器官功能的生物替代物的學科[2,3]。

在小兒外科臨床工作中，腫瘤、先天畸形、創(chuàng)傷和感染常導致組織(器官)缺損，需要足夠數(shù)量的組織進行結(jié)構(gòu)和功能的外科重建[4,5]。但和成人相比，兒童自體組織體積小，取組織后供區(qū)殘留畸形，影響美觀。而同種異體器官移植作為一種替代方案，也存在可供移植供體器官短缺的問題[6]。即便確定了合適的供體并進行了移植，供體器官的排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的毒性作用也讓兒童器官移植工作發(fā)展緩慢[7,8]。隨著組織工程的發(fā)展，基于少量自體材料開展的組織工程修復重建能減少損傷，達到長期的功能修復與重建[4,5,9]。因兒童機體可持續(xù)生長的特性，其細胞來源的工程化組織是研究疾病機制和新治療方法的寶貴模型，組織工程與修復重建在小兒外科也得到了長足的發(fā)展。本文介紹組織工程與修復重建在小兒外科的發(fā)展，并討論其所面臨的機遇及挑戰(zhàn)。

一、組織工程與修復重建在小兒外科領(lǐng)域的技術(shù)進展

組織工程與重建外科的基本程序是先從機體獲取少量活體組織，用特殊的酶或其他方法將細胞(又稱種子細胞)從組織中分離出來，在體外進行培養(yǎng)擴增，然后將擴增的細胞與具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定比例混合，使細胞黏附在生物材料(支架)上形成細胞-材料復合物，隨后將該復合物植入機體的組織或器官病損部位。隨著生物材料在體內(nèi)逐漸被降解和吸收，植入的細胞在體內(nèi)不斷增殖并分泌細胞外基質(zhì)，最終形成相應(yīng)的組織或器官，從而達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的[10,11]。它雖然是細胞學、材料學、免疫學、基因工程、仿生學、康復醫(yī)學等多學科交叉融合的產(chǎn)物，但其基礎(chǔ)仍是種子細胞、生物材料和組織構(gòu)建，這三要素的研究發(fā)展是其進步和發(fā)展的基礎(chǔ)。

(一)種子細胞

自體成體細胞來源有限，且生長緩慢，應(yīng)用潛力小。胚胎和胎兒組織來源的干細胞雖然分化能力強，但存在倫理和成瘤安全性問題。成體干細胞來源廣泛，增殖潛力強，但分裂次數(shù)有限，易累積遺傳變異。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技術(shù)通過導入特定的轉(zhuǎn)錄因子，將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞，不使用胚胎細胞或卵細胞，因此不存在倫理學問題，降低了發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的可能性[12,13]。Hayashi等[14]研究開發(fā)了一種2D培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過促進iPSCs的自發(fā)分化，制造出功能性的角膜上皮組織，并通過動物模型驗證。Kannappan等[15]利用iPSCs在體外培養(yǎng)心肌細胞，之后將這些細胞處理制作成“貼片”附于心肌壞死的部位得到有效的修復，基于該方法的實驗和臨床試驗證據(jù)也顯示，心臟左心室的泵送能力得到改善。Ouchi[16]利用源自健康人類供體和肝臟疾病患者的iPSCs，開發(fā)了一種生物工程復合多細胞肝臟的方法，包含肝細胞、星狀細胞和Kupffer樣細胞等，能在實驗室中重現(xiàn)炎癥、纖維化和肝病的特征。目前iPSCs在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等，但其免疫原性、潛在致瘤性與表觀遺傳學變異問題仍是臨床應(yīng)用的主要隱患[17]。

(二)生物材料

生物材料在推動組織工程領(lǐng)域的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，是生命科學、醫(yī)學、材料科學和工程等學科結(jié)合的產(chǎn)物[18]。生物材料可用來替換、修復和維持器官結(jié)構(gòu)，在過去的二十余年中，許多支架被開發(fā)用于各種組織工程。然而，部分支架的缺點在于機械材料失效、材料相關(guān)感染和機體對植入材料的免疫原性反應(yīng)?？紤]到這些局限，為兒童應(yīng)用而設(shè)計的支架需要進一步改進，即材料必須隨著生理和環(huán)境的變化、植入時間的增長而發(fā)生生長和重塑。此外，也要考慮到兒童免疫排斥反應(yīng)隨年齡增大而出現(xiàn)一些變化的可能。

天然支架由蛋白質(zhì)或碳水化合物組成，具有特殊的生化、機械和結(jié)構(gòu)特性。它們可以從植物或動物組織中提取，具有生物相容性和生物降解性。例如膠原蛋白、殼聚糖、透明質(zhì)酸、纖維蛋白和明膠都是天然的支架材料，已經(jīng)應(yīng)用于組織的修復和重建[19,20]。豬皮膠原蛋白是一種商業(yè)化移植物，呈片狀，無細胞，不引起免疫反應(yīng)，可用于腹壁缺損患者。由有機硅衍生物與透明質(zhì)酸片段結(jié)合而成的復合物已經(jīng)被用于治療兒童燒傷患者，能完全覆蓋真皮，促進皮膚愈合。其基質(zhì)的降解速度較慢，為傷口完全愈合提供了足夠的時間[21]。Ruszymah以纖維蛋白為支架培養(yǎng)耳廓軟骨細胞，可用于制備彈性軟骨[22]?；蜓芯勘砻?，組織工程軟骨與天然彈性軟骨相似，可作為兒童耳再造手術(shù)的支架。Guyette等[23]使用器官捐贈者的心臟去細胞支架作為材料，接種人的iPSCs及其誘導成的心肌細胞來構(gòu)建組織工程心臟獲得成功，構(gòu)建的“心臟”具有電傳導性、收縮和新陳代謝功能。

人工合成的生物材料由于其物理和生物特性可被改變，且可以大量復制，而成為目前熱門的支架材料。合成生物材料包括乙醇酸衍生物、乳酸衍生物和其他聚酯衍生物、水凝膠等。Shin’oka等[24]采用L-丙交酯/ε-己內(nèi)酯(1∶1)共聚物作為兒童自體骨髓細胞的支架，制作全腔靜脈肺動脈連接的導管和先天性心臟缺陷的補片，患者平均年齡5.5歲，隨訪1.3～31.6個月，導管和補片功能與活體組織相同，CT斷層掃描顯示沒有動脈瘤形成或鈣化。隨著時間的推移，導管直徑增大，而目前的人工假體植入物則沒有這種生長能力。Roh等[25]用聚己內(nèi)酯-丙交酯共聚物包被聚乙醇酸網(wǎng)構(gòu)建可生物降解管狀支架，為兒童心血管組織工程應(yīng)用創(chuàng)造了一種具有修復、重塑和生長潛能的血管支架。

水凝膠是由在水溶液中膨脹的聚合物鏈組成的，可以是天然的，也可以是合成的，可以在體內(nèi)被天然酶降解并最終被吸收。水凝膠具有典型的生物相容性，含水量大，不引起免疫反應(yīng)和炎癥。因此，水凝膠可以用來包裹細胞和制作支架[26]。水凝膠也可采用注射的形式用于修復不規(guī)則形狀的缺損，也用于整形手術(shù)。這些凝膠在藥物傳遞和細胞包裹方面得到了廣泛研究。有學者以可降解水凝膠和不可降解高密度聚乙烯為內(nèi)固定支架，用人鼻中隔軟骨細胞在無胸腺小鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程氣管，顯示了很好的生物相容性，可見細胞外基質(zhì)形成[27]。硅水凝膠隱形眼鏡在兒童近視方面也得到了廣泛應(yīng)用。

隨著科技的進步，更多新型的支架材料不斷問世，比如具有導電性能的石墨烯材料支架、具有雙向磁性的納米支架、新型含銅金屬心血管支架材料等。制備支架的方法也在逐漸更新?lián)Q代，如靜電紡絲技術(shù)、冷凍干燥法、自組裝法等。研究者仍在進一步增加材料的生物相容性，使其具備一定的穩(wěn)定性和可降解性，將分解產(chǎn)物對機體的毒害作用盡量減少，或開發(fā)無毒產(chǎn)品。此外，還將研究重點放在提高種子細胞在支架材料內(nèi)的生物活性、創(chuàng)造種子細胞成活的微環(huán)境上。

組織工程學最基本也最容易應(yīng)用于臨床的形式是細胞膜片工程學，首先將細胞加工成膜片狀，然后在此基礎(chǔ)上進行組織的構(gòu)建。細胞一旦成功分散到天然或合成支架上，就可以在體外保存或直接植入宿主體內(nèi)[28]。如果希望擴大細胞群并調(diào)節(jié)支架，則需將支架保持在“生物反應(yīng)器”中，這是一種維持生理上有利環(huán)境(溫度、大氣、營養(yǎng)介質(zhì)、機械力學等)的裝置，使種植在支架上的細胞增殖和分化達到最佳狀態(tài)。如循環(huán)應(yīng)力可以改善肌肉組織的力學性能，與行走速度相似的周期性壓縮可增強軟骨的合成，拉伸應(yīng)力在肌腱和韌帶的損傷工程中非常重要。組織工程心臟需要電起搏刺激細胞收縮，肺組織需要通風系統(tǒng)，使細胞能夠具備交換氧氣的能力[29]。

組織工程室與在體血管預構(gòu)技術(shù)相結(jié)合是近年來的新興研究方向。組織工程室采用具有一定硬度的材料，在體內(nèi)隔離出一個相對封閉的空間，再向其內(nèi)放入種子細胞、支架材料或待培養(yǎng)組織，能夠顯著提高移植物存活率[30]。Morrison等[31]報道在患者體內(nèi)利用多孔穹隆狀的組織工程室成功進行脂肪的體積擴增，但大部分組織工程室的研究仍處于動物實驗階段，臨床應(yīng)用還有很多工作需要完成。

3D打印技術(shù)是上世紀80年代出現(xiàn)的一種快速成型技術(shù)，由計算機輔助設(shè)計數(shù)據(jù)通過成型設(shè)備，以材料逐層堆積的方式實現(xiàn)三維實體成型[32]。通過3D生物打印技術(shù)制備出來的組織可顯示出良好的再生能力[33]。3D生物打印技術(shù)與干細胞的整合在組織工程領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的潛力，利用3D生物打印技術(shù)打印出來的組織工程支架可在時間和空間上做到足夠精確，按需沉積不同種類的細胞、材料、生長因子等，構(gòu)造出來的組織可以與缺損組織的解剖結(jié)構(gòu)相匹配[34]。

Lueders使用水凝膠和臍帶血干細胞打印出心臟瓣膜，生物性能良好[35]。O’Connell等[36]將甲基丙烯酸酯化明膠和甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸作為基底材料， 混合脂肪干細胞，在軟骨損傷部位用生物打印筆進行原位打印，紫外光照射固化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3D打印成型的干細胞存活率高，軟骨損傷修復快。Di Bella等[37]發(fā)明了一種手持式3D打印設(shè)備，用于一期修復綿羊股骨內(nèi)外側(cè)髁負重面全層軟骨缺損，均獲得成功，無并發(fā)癥。Kizawa等[38]應(yīng)用3D打印技術(shù)成功打印具有代謝功能的人類肝臟組織。

迄今為止，隨著生物墨水及相關(guān)材料的研發(fā)，3D生物打印機已經(jīng)成功打印出了氣管、食管、皮膚、耳、腎臟、肝臟和血管等人體組織器官，并應(yīng)用于臨床。但目前仍只能打印靜態(tài)的組織，存在打印后細胞活力無法保證的問題[39]。

二、組織工程與修復重建在小兒外科應(yīng)用的局限及展望

組織工程學的提出、建立和發(fā)展不但為修復、替代或再生缺損組織提出了更先進的方法，而且可以緩解供區(qū)缺損和不足，同時減少住院的時間和費用。因此，組織工程技術(shù)在修復重建外科領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景。目前組織工程在兒童骨科、泌尿外科、普外科、神經(jīng)外科、心胸外科等領(lǐng)域已有大量臨床應(yīng)用實例。骨和軟骨組織工程用于修復骨和軟骨缺損技術(shù)已應(yīng)用于臨床。組織工程尿道用于尿道下裂修復也有臨床報道。組織工程自體角質(zhì)形成細胞薄片用于燒傷后表皮再生的研究已獲成功，并有相應(yīng)產(chǎn)品問世。組織工程治療先天性心血管畸形、短腸綜合征、氣管置換、神經(jīng)損傷等均有少量病例研究，但還沒有廣泛臨床應(yīng)用。雖然組織工程與修復重建技術(shù)在小兒外科領(lǐng)域取得了長足的發(fā)展，但因為兒童生理及小兒外科疾病病理的特殊性，仍面臨一系列具體的科學和技術(shù)層面的挑戰(zhàn)[5,13]。

目前，組織工程和重建外科還不能完全做到解剖重建和功能重建，尚不能提供完整的組織和器官信息，供組織工程和重建外科參考，因此有必要構(gòu)建一套新的基礎(chǔ)科學理論體系，來整合所有關(guān)于組織和器官的解剖、生理、生化信息，表達組織或器官應(yīng)有的時間、空間等生物學特性。目前組織工程移植物和正常組織結(jié)構(gòu)還存在一定差距，不能完全具備正常組織的所有功能。移植物和受體的組織相容性以及移植物血管化、神經(jīng)支配、內(nèi)分泌等問題仍有待解決[13]。所以需要進一步研究基礎(chǔ)干細胞/發(fā)育生物學、材料科學、解剖學和外科技術(shù)之間的相互作用，選擇合適的細胞來源，更好地理解和控制生物過程(如干細胞/祖細胞的分離、擴增和分化)，通過3D生物打印等方式生成特定的形狀和三維結(jié)構(gòu)，增強生物反應(yīng)器系統(tǒng)制造過程的穩(wěn)定性，保證移植物的可生長性，促進功能性植入。

尤其需要指出的是，兒童疾病的生理和病理與成人大不相同。組織工程學中有些為成年人設(shè)計的治療方法并不適用于兒童。兒童所需種子細胞、生物因子的量仍處于摸索階段，這些治療方法的療效也并不確切[16]。由于兒童一直處于生長發(fā)育過程之中，組織工程產(chǎn)生的組織需要考慮能否隨患兒生長而生長，而激素的變化可能會對移植物產(chǎn)生影響，因此有必要開展針對兒童先天性缺陷和疾病的動物模型研究，提高對組織工程和重建外科的機制認知，提高療效，減少并發(fā)癥的發(fā)生。

此外，在組織工程和重建外科的應(yīng)用過程中，越來越多的倫理學問題也逐漸凸顯，例如如何獲得胚胎和胎兒組織來源的干細胞以及安全性問題，植入動物來源的支架材料可能引發(fā)的不良反應(yīng)，基因工程技術(shù)引入組織工程的安全性，組織工程和修復重建在胎兒應(yīng)用的風險及費效比等，都是需要患者和醫(yī)生密切關(guān)注的問題[40]。

近年來，組織工程與修復重建在小兒外科領(lǐng)域已進入快速發(fā)展時期，并將不斷深入。相信在不久的將來，組織工程產(chǎn)品會在小兒外科組織器官的缺損修復重建過程中得到廣泛應(yīng)用。同時，隨著組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標準化、修復重建流程化及醫(yī)學倫理學研究的深入，相關(guān)的法律法規(guī)也將陸續(xù)出臺，對其進行規(guī)范，倫理道德方面的問題也將迎刃而解。