多重PCR-毛細(xì)管電泳檢測(cè)兒童5種腹瀉病毒的方法建立及應(yīng)用*

蔡德豐，陳運(yùn)生，朱純青，孟青，肖麗霞，田潔，馬東禮

(1. 深圳市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，深圳 518038；2. 亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司，深圳 518000)

急性腹瀉在全球均有較高的發(fā)病率和死亡率，主要發(fā)生在兒童和老年人群[1]。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見(jiàn)病毒包括輪狀病毒(rotaviruses，RV)、諾如病毒(norovirus，NoV)、腸道腺病毒(adenoviruses，Adv)、扎如病毒(sapovirus，SV)及星狀病毒(human astroviruses，HAstV)[2-3]。目前約40%的腹瀉并不能快速準(zhǔn)確診斷出病因[4-5]。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長(zhǎng)；免疫學(xué)方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染；單病原體的PCR方法檢測(cè)通量較低。本研究首次以兒童常見(jiàn)腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標(biāo)，建立多重PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)體系，以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。

1 材料和方法

1.1臨床樣本與標(biāo)準(zhǔn)毒株 收集2017—2018年深圳市兒童醫(yī)院185例兒童感染性腹瀉(診斷標(biāo)準(zhǔn)：感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)，WS 271-2007)樣本；Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV的標(biāo)準(zhǔn)毒株(參考品)購(gòu)于廈門(mén)至善生物公司。特異性評(píng)價(jià)的細(xì)菌株及毒株腸致病型大腸埃希菌、痢疾志賀菌、副溶血弧菌、腸炎沙門(mén)菌及腸道病毒71型來(lái)自深圳市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑和儀器 Hotstart HiTaq一步法RT-PCR Mix(廣東菲鵬生物公司)，引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司(上海)合成，瓊脂糖(西班牙索萊寶生物公司)，磁珠法病毒總核酸提取試劑盒(廣州美基生物公司)，TGuide S32半自動(dòng)樣本提取儀(北京天根生物公司)；QSEP 100毛細(xì)管電泳儀、S1 High resolution凝膠卡匣(中國(guó)臺(tái)灣光鼎公司)。測(cè)序送上海生工生物公司。

1.3核酸提取 將10 μL參考品稀釋至200 μL；配制108/mL各細(xì)菌水溶液，95 ℃ 10 min，12 000 r/min 10 min。取200 μL稀釋后參考品、腹瀉樣本及細(xì)菌提取液于TGuide S32半自動(dòng)樣本提取儀上提取核酸，參照磁珠法病毒總核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增體系及條件建立 從NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索病毒基因組或某個(gè)保守基因的全長(zhǎng)序列，篩選出相應(yīng)病毒的檢測(cè)靶點(diǎn)：Adv(Hexon)、NoV G1(ORF1-ORF2junction1)、NoV G2(ORF1-ORF2junction2)、RV A(NSP3)、HAstV(ORF1-ORF2之間保守序列)、SV(RdRp-VP1junction)；將參考序列保守性最高的500～600 bp候選區(qū)域輸入JCVIPrimer Designer生成候選的簡(jiǎn)并引物，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為25 μL：5×OneStep Reverse Buffer(Mg2+)5 μL，10×Solution I 2.5 μL，dNTP 0.05 μL，dN(U)TP 0.35 μL，Primer Pool 2.5 μL，Enzyme Mix 2 μL，模板 5 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR擴(kuò)增條件方案：(1)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.7 ℃)，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(2)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(3)常規(guī)PCR擴(kuò)增條件：50 ℃ 15 min，95 ℃10 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s。并對(duì)多重降落PCR、常規(guī)PCR擴(kuò)增進(jìn)行比較。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓160 V，時(shí)間35 min，用Biorad PowerPac進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 本文所使用引物

注：簡(jiǎn)并堿基Y代表C/T，R代表A/G，K代表G/T，W代表A/T，M代表A/C。

1.5毛細(xì)管電泳檢測(cè) 取20 μL擴(kuò)增后核酸樣本，使用QSEP 100毛細(xì)管電泳儀和S1 High resolution凝膠卡匣對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)程序?yàn)镠igh Voltage Purge 4 V 60 s；Marker Injection 4 V 10 s；Sample Injection 4 V 2 s；Separation Detection 4 V 210 s，計(jì)282 s。使用marker為lower marker：20 bp，upper marker：1 000 bp，YN sep Analyzer 軟件判讀的擴(kuò)增片段。

1.6體系靈敏度、特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性驗(yàn)證 將標(biāo)準(zhǔn)毒株(3×1011copies/μL)進(jìn)行10倍梯度稀釋，濃度范圍3×102～3×310copies/μL，每個(gè)濃度進(jìn)行20次重復(fù)試驗(yàn)，將能夠檢出的最低稀釋濃度定義為靈敏度。以Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV為目的擴(kuò)增毒株，以其他引起腹瀉的病原菌(腸致病型大腸埃希菌、痢疾志賀菌、副溶血弧菌、腸炎沙門(mén)菌及腸道病毒71型)為非目的病原體制備模板，在優(yōu)化的多重PCR-毛細(xì)管電泳體系下進(jìn)行分析。通過(guò)本體系對(duì)檢出限進(jìn)行20次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算峰面積，根據(jù)峰面積差異計(jì)算變異系數(shù)(CV)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性[6]。將PCR擴(kuò)增試劑25 ℃加速破壞5 d，反復(fù)凍融20次，對(duì)濃度為檢出限的稀釋毒株進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)病毒重復(fù)檢測(cè)5次，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。

1.7臨床樣本檢測(cè) 采用建立方法檢測(cè)185例臨床樣本。

1.8測(cè)序驗(yàn)證 隨機(jī)選擇5例建立方法檢測(cè)陽(yáng)性的RV感染樣本，經(jīng)提取核酸后，對(duì)編碼RV結(jié)構(gòu)蛋白的VP4及VP7基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，53 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 s。然后對(duì)擴(kuò)增后VP4及VP7基因片段進(jìn)行雙端測(cè)序分析，擴(kuò)增和測(cè)序采用同一對(duì)引物，見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)毒株P(guān)CR產(chǎn)物分析 通過(guò)對(duì)不同3種擴(kuò)增條件的比較，最終選擇方案(1)(見(jiàn)1.4)的降落條件，可見(jiàn)5種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度一致，引物設(shè)計(jì)合理。見(jiàn)圖1。

注：1，Adv；2，HAstV；3，NoV G1；4，NoV G2；5，RV；6，SV；7，5種病毒混合條帶；M，marker。

圖1PCR擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2毛細(xì)管電泳技術(shù)建立 5種病毒陽(yáng)性參考品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后均檢測(cè)到相應(yīng)片段，無(wú)明顯的干擾雜峰出現(xiàn)，其他腹瀉病原體核酸對(duì)反應(yīng)體系無(wú)影響，見(jiàn)圖2。各病毒的檢出限及CV分別為：Adv 2.04×103copies/μL，CV=6.96%；HAstV 3.99×103copies/μL，CV=7.24%；SV 8.56×102copies/μL，CV=9.03%；NoV G1 6.94×102copies/μL，CV=7.63%；NoV G2 7.38×103copies/μL，CV=8.12%；RV 2.20×102copies/μL，CV=8.89%。各病毒檢出限的CV均小于10%。擴(kuò)增試劑在25 ℃ 5 d及反復(fù)凍融20次后，位于檢出限濃度的毒株均能夠檢出。

注：A，RV(91 bp)；B，SV(112 bp)；C，Adv(126 bp)；D，HAstV(241 bp)；E，NoV G2(352 bp)；F，NoV G1(399 bp)；LM，low marker；UM，up marker。

圖25種腹瀉病毒陽(yáng)性參考品毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 185例臨床腹瀉樣本中132例檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為71.35%。感染方式分析：?jiǎn)尾《靖腥?01例(54.6%)、雙病毒感染31例(16.8%)和無(wú)信號(hào)陰性樣本53例(28.6%)。其中，Adv 22例(11.9%)、HAstV 10例(5.4%)、NoV G1 0例(0%)、NoV G2 11例(5.9%)、RV A 105例(56.8%)和SV 15例(8.1%)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：A—E，分別為 Adv和RV(91 bp，125 bp)混合感染、RV和NoV G2(91 bp，356 bp)混合感染、SV(113 bp)感染、RV A(92 bp)感染、Adv(120 bp)感染、HAstV(240 bp)感染；LM，low marker；UM，up marker。

圖3部分臨床樣本核酸毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4測(cè)序結(jié)果分析 將編碼RV結(jié)構(gòu)蛋白的VP4及VP7基因的測(cè)序結(jié)果與GeneBank比對(duì)分析，結(jié)果序列一致。VP4及VP7部分測(cè)序序列見(jiàn)圖4。

圖4 RV病毒VP4(A)及VP7(B)部分基因片段測(cè)序結(jié)果

3 討論

本研究選取病毒保守序列進(jìn)行PCR分析，在設(shè)計(jì)引物同時(shí)注意病毒間產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異化，以便于毛細(xì)管電泳的直觀判斷分析。首先對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，摸索出基于降落PCR技術(shù)的最終擴(kuò)增反應(yīng)條件，以保證擴(kuò)增效率及擴(kuò)增穩(wěn)定性。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶；陽(yáng)性參考品經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)條帶長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度基本一致，未出現(xiàn)明顯非特異性檢測(cè)峰；雖YN sep Analyzer軟件判讀后，與實(shí)際片段存在一定差異，這與實(shí)驗(yàn)條件中存在誤差有一定關(guān)系，并不影響結(jié)果判斷。本研究建立的方法與大腸埃希菌﹑痢疾志賀菌﹑副溶血弧菌﹑腸炎沙門(mén)菌及腸道病毒71型腹瀉病原體無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)；Adv、NoV G1、RV A、SV及HAstV檢出限均小于5×103copies/μL，NoV G1小于1×104copies/μL，具有較好的敏感性；在重復(fù)性方面，CV均小于10%；擴(kuò)增試劑在25 ℃ 5 d及反復(fù)凍融20次，位于檢出限濃度的毒株均能夠檢出，穩(wěn)定性較好；通過(guò)對(duì)輪狀病毒結(jié)構(gòu)基因VP4及VP7進(jìn)行測(cè)序分析，與GeneBank的標(biāo)準(zhǔn)序列一致，具有較高的準(zhǔn)確性，能夠滿足臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的需求。本檢測(cè)方法檢測(cè)通量高，適合批量檢測(cè)；且分析系統(tǒng)能夠?qū)γ?xì)管電泳的電泳圖譜及檢測(cè)峰自動(dòng)分析，結(jié)合marker分析片段的長(zhǎng)度，根據(jù)片段長(zhǎng)度判斷腹瀉病毒的種類；該檢測(cè)體系從樣本處理到分析出結(jié)果近3 h，相比其他檢測(cè)手段具有高通量、低成本、臨床操作性強(qiáng)及檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)室需配備凝膠電泳儀及培訓(xùn)后的專業(yè)檢測(cè)人員。

185例臨床腹瀉樣本經(jīng)本體系檢出132例病毒感染，陽(yáng)性率達(dá)71.35%，5種腹瀉病毒均檢出；單病毒感染及復(fù)合病毒感染分別為101例及31例，以單病毒感染為主；腹瀉病毒檢出情況包括RV A感染105例、Adv 22例、SV 15例、NoV G2 11例和HAstV 10例，主要集中在輪狀病毒和腺病毒，與Thongprachum等研究結(jié)果基本一致[2]。