自組裝核酸適配子探針在深部真菌感染可視化檢測(cè)中的應(yīng)用*

孟偉，王雯，章宏祥，周發(fā)友，唐曉磊

(1. 鄒城市人民醫(yī)院輸血科，山東鄒城 273500；2. 濱州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州 256600；3. 皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241000)

深部真菌感染(deep fungal infection, DFI)目前呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且其以進(jìn)展快和致死率高為臨床廣泛關(guān)注[1]。對(duì)真菌特異性的(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)，能夠反映機(jī)體感染真菌的情況。目前臨床對(duì)DFI(尤其是酵母型真菌)診斷主要利用G試驗(yàn)，而臨床標(biāo)本取材質(zhì)量對(duì)G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果有不同程度的影響；藥物、飲食、紗布甚至空氣等不同來(lái)源的葡聚糖等也可引起結(jié)果假陽(yáng)性。本研究通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選獲得能夠特異性結(jié)合(1，3)-β-D-葡聚糖的核酸適配子，利用單鏈核酸適配子折疊的特定空間構(gòu)象識(shí)別靶標(biāo)，能夠有效區(qū)分不同來(lái)源的葡聚糖，減少假陽(yáng)性。并通過(guò)對(duì)配基的設(shè)計(jì)使其帶有自組裝顯色系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)通過(guò)肉眼觀察顏色判讀結(jié)果。

1 材料和方法

1.1菌株及臨床樣本 白念珠菌ATCC 900291(武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心)；E.coliDH5α菌體(上?；鶢栴D生物科技公司)。68例DFI患者血清來(lái)源于濱州市人民醫(yī)院和鄒城市人民醫(yī)院，其中男46例、女22例，年齡42～87歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)患者具有真菌感染的相關(guān)癥狀；(2)培養(yǎng)檢出酵母型真菌或標(biāo)本鏡檢查出孢子；(3)G試驗(yàn)陽(yáng)性；(4)用抗真菌藥物治療效果顯著，納入本研究中的患者必須達(dá)到至少3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。68例患者均存在感染癥狀，且其中59名G試驗(yàn)陽(yáng)性數(shù)據(jù)分布為116～282 pg/mL，在使用抗真菌藥物治療后61例明顯好轉(zhuǎn)，21例患者培養(yǎng)出真菌(樣本分布為4例靜脈導(dǎo)管尖端、2例胸腔積液、2例皮下膿腫、13例痰液，檢出菌株為白念珠菌13例、熱帶假絲酵母菌3例、克柔假絲酵母菌1例、毛霉菌3例，曲霉菌1例)；32例患者涂片染色檢出孢子或菌絲。健康人對(duì)照組血清來(lái)源于皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院無(wú)臨床感染癥狀的體檢健康者，共81例，男55例，女26例，年齡22～71歲。

1.2主要儀器及試劑 ssDNA文庫(kù)和引物合成(上海生工公司)，pUC19質(zhì)粒(上海基爾頓生物公司)，血晶素(hemin)和鱖魚(yú)精DNA(Sigma公司)，PCR mixture(Promega公司)，限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和Hind Ⅲ(TaKaRa公司)，葡聚糖酶(上海源葉公司)，G試驗(yàn)試劑(湛江安度斯生物公司)，其余化學(xué)試劑(國(guó)藥化工)；HH-4型水浴鍋(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，Multiskan FC酶聯(lián)儀(賽默飛公司)，GC Smart氣相色譜(島津公司)，H2500R離心機(jī)(湘儀有限公司)，ABI 2700 PCR儀(ABI公司)。

1.3(1，3)-β-D-葡聚糖的提取、水解及鑒定 采用堿酶解法從白念珠菌ATCC 900291菌株中提取高聚合度的葡聚糖[2]。經(jīng)過(guò)1 mg/mL β-葡聚糖酶37 ℃酶解4 h，10 000×g10 min，取上清液15 μL與2 μL 10×loading混合，行SDS-PAGE分離和糖原染色分析。通過(guò)HPLC(Agilent 1260)分離純化豐度較高的低分子量(1，3)-β-D-葡聚糖，行氣相色譜鑒定。取2 mg多糖樣品，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液，于110 ℃下酸水解2 h。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，溶液于40 ℃減壓蒸發(fā)至干，再加3 mL甲醇蒸干，完全水解后的樣品溶解于2 mL去離子水中，加入20～30 mg NaBH4，間歇振蕩，室溫下進(jìn)行還原反應(yīng)4 h，然后用體積分?jǐn)?shù)為25%的醋酸中和未反應(yīng)的NaBH4，至溶液不再產(chǎn)生氣泡為止，加甲醇5次(每次3 mL)，減壓蒸干。100 ℃加熱15 min，除去殘留水分，加3 mL乙酸酐，密閉后于100 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，加甲苯5次(每次3 mL)，反復(fù)減壓蒸發(fā)，直至完全干燥。將乙?；a(chǎn)物用8 mL氯仿萃取，經(jīng)等體積去離子水洗滌4次，氯仿層用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮至體積約0.2 mL后直接進(jìn)行氣相色譜法分析。

1.4適配子的篩選及鑒定 設(shè)計(jì)適配子文庫(kù)為：5′-TCTAGAATCCCAATCCCAATCCCA-N50-ACCCTAAAGCTT-3′(共計(jì)86個(gè)堿基，N為隨機(jī)堿基：A、T、G及C，單下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)序列，雙下劃線為G四聯(lián)體反向序列，N50為長(zhǎng)度50個(gè)堿基的隨機(jī)序列)；引物P1：5′-TCTAGAATCCCAATCCCAATCCCA-3′，P2：5′-AAGCTTTAGGGT-3′。將50 μL/孔(1，3)-β-D-葡聚糖(10 μg/mL)包被于聚苯乙烯微孔中，37 ℃濕盒1 h，鱖魚(yú)精DNA經(jīng)超聲裂解15 min后以100 μg/mL進(jìn)行封閉。將合成的ssDNA文庫(kù)(10 nmol)溶于篩選緩沖液(1.8 mmol/L CaCl2,2.68 mmol/L KCl,1.47 mmol/L KH2PO4,3.98 mmol/L MgSO4, 136.9 mmol/L NaCl，8.06 mmol/L Na2HPO4)，95 ℃ 10 min后立即冰上冷卻5 min，每孔加入1 nmol文庫(kù)，37 ℃濕盒1 h，棄上清液，使用洗滌緩沖液(含0.1%吐溫-20的篩選緩沖液)洗滌微孔3次，每次3 min。每孔加100 μL去離子水，95 ℃ 10 min，取上清液為模板行不對(duì)稱(chēng)PCR。50 μL PCR體系：模板2 μL，P1和P2(0.1 μmol/L)各1 μL，2×PCR mixture 25 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，12個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)過(guò)8輪正向篩選以及4輪微孔和血清的負(fù)向篩選，將其克隆至pUC19質(zhì)粒并導(dǎo)入E.coliDH5α菌體，挑取單克隆并利用酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗(yàn)(enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA)比較單克隆適配子的相對(duì)結(jié)合力高低，并選取結(jié)合力較高的適配子驗(yàn)證其識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的一致性。

1.5適配子序列的結(jié)構(gòu)改造及結(jié)合力驗(yàn)證 對(duì)1.4中篩選所得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行添加G四聯(lián)體序列。并利用ELONA比較單克隆適配子的相對(duì)結(jié)合力大小及特異性。取(1，3)-β-D-葡聚糖(10 μg/mL)包被聚苯乙烯微孔，每孔50 μL，加入10 nmol/L生物素標(biāo)記的適配子以及等摩爾數(shù)改造后的含G四聯(lián)體適配子，前者使用鏈霉親合素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶顯色系統(tǒng)，后者加入hemin使之形成獨(dú)立的顯色系統(tǒng)，催化H2O2生成游離氧氧化四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，通過(guò)酶聯(lián)儀檢測(cè)A450 nm。

1.6添加G四聯(lián)體適配子的檢測(cè)性能 將不同濃度(1，3)-β-D-葡聚糖(400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.125 pg/mL、1.6 pg/mL、0.8 pg/mL、0 pg/mL)包被聚苯乙烯微孔(每孔50 μL)，鱖魚(yú)精DNA封閉，加入100 nmol/L G四聚體加尾的適配子，加入hemin使之形成獨(dú)立的顯色系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)20 min顯色，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，通過(guò)酶聯(lián)儀檢測(cè)A450 nm。

1.7適配子自顯色系統(tǒng)對(duì)臨床標(biāo)本檢測(cè) 149份樣本同時(shí)用G試驗(yàn)試劑盒和適配子自顯色系統(tǒng)檢測(cè)，G試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，陽(yáng)性判讀根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)。適配子自顯色系統(tǒng)由81例陰性血清與68例陽(yáng)性(確診為DFI患者)血清測(cè)得A450 nm值擬合后形成的ROC曲線，根據(jù)約登指數(shù)(敏感性+特異性-1)擬合確定cut off值，≤cut off值為陰性，>cut off 值為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1水溶性低聚合度(1，3)-β-D-葡聚糖的分離及鑒定 堿酶解法提取(1，3)-β-D-葡聚糖經(jīng)內(nèi)切型葡聚糖酶消化處理后，熱變性除去蛋白質(zhì)成分離心后取上清液行SDS-PAGE分離且使用糖原染色，可見(jiàn)水溶性(1，3)-β-D-葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在3個(gè)范圍：<1 700、4 600和10 000～15 000，見(jiàn)圖1A。且分子量<1 700的低聚合度葡聚糖豐度較高。使用切膠回收方式將其提取并行190～900 nm波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，其在196 nm處顯示有吸收峰，見(jiàn)圖1B；對(duì)其進(jìn)行元素分析顯示，C∶H∶O 3種元素的比值約為1∶2∶1(C、H、O、N元素摩爾數(shù)之比為1.012∶2.034∶1.068∶0.027)，符合糖類(lèi)碳水化合物的元素組成特征。且經(jīng)氣相色譜分析，提取的低聚合度糖出峰保留時(shí)間為5.896 min，與所使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間6.079 min較為一致，見(jiàn)圖1C和圖1D。

注：A，SDS-PAGE分離水溶性(1，3)-β-D-葡聚糖后經(jīng)糖原染色鑒定，箭頭示低聚合度；B，波長(zhǎng)掃描分析水溶性(1，3)-β-D-葡聚糖吸收峰；C，氣相色譜法用于分析單糖對(duì)照(單糖標(biāo)準(zhǔn)品從左向右箭頭指示分別為：鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和木糖)；D，氣相色譜法用于分析提取的水溶性(1，3)-β-D-葡聚糖的單糖成分,箭頭表示提取的水溶性低聚合度(1，3)-β-D-葡聚糖。

圖1水溶性(1，3)-β-D-葡聚糖的分離及鑒定

2.2適配子的篩選及鑒定 經(jīng)過(guò)8輪正向篩選和4輪負(fù)向篩選，其每一輪文庫(kù)之間相對(duì)結(jié)合力的比較發(fā)現(xiàn)，第8輪文庫(kù)的相對(duì)結(jié)合力與第7輪比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示篩選接近平臺(tái)期。將第8輪文庫(kù)克隆進(jìn)pUC19質(zhì)粒，挑起單克隆，將單克隆中相對(duì)結(jié)合力及特異性較高的6個(gè)適配子(分別命名為A1、A2、A3、A4、A5和A6)進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，6個(gè)適配子中能夠分別識(shí)別4個(gè)不同的位點(diǎn)，即A1與A3識(shí)別同一個(gè)位點(diǎn)，A2與A4識(shí)別同一個(gè)位點(diǎn)，A5與A6分別識(shí)別不同的位點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

注：A，不同適配子ssDNA文庫(kù)相對(duì)結(jié)合力的比較；L,起始文庫(kù)；1st—8th，分別為第1輪至第8輪篩選所得的文庫(kù)。B和C，為競(jìng)爭(zhēng)法驗(yàn)證適配子A1—A6結(jié)合位點(diǎn)，Bio-為生物素標(biāo)記的適配子，其余為未標(biāo)記適配子。

圖2適配子的篩選及結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

2.3適配子加G四聯(lián)體序列的性能比對(duì) 將核心序列與改造后的序列進(jìn)行相對(duì)結(jié)合力檢測(cè)，結(jié)果顯示，4種適配子結(jié)合力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。將4種改進(jìn)的適配子等摩爾數(shù)配制對(duì)不同濃度的(1，3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行檢測(cè)，表明其靈敏度在3.125 pg/mL時(shí)仍有肉眼可見(jiàn)的顏色，用酶聯(lián)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其在1.6～400 pg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖4。

圖3篩選的適配子及適配子/G四聯(lián)體復(fù)合物的結(jié)合性能比較

2.4適配子自組裝顯色系統(tǒng)與G試驗(yàn)的結(jié)果比對(duì) 對(duì)149份(68份DFI患者血清和81份體檢健康者血清)標(biāo)本分別使用2種方法進(jìn)行檢測(cè)，適配子自組裝顯色系統(tǒng)使用酶聯(lián)儀測(cè)得的A450 nm值繪制ROC曲線，見(jiàn)圖5，其cut off值為0.613；G試驗(yàn)說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明結(jié)果大于等于20 pg/mL為陽(yáng)性。檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，適配子顯色法的敏感性和特異性分別為98.53%和88.89%；G試驗(yàn)的敏感性和特異性分別為86.76%和96.29%；2種方法檢測(cè)效能比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.373,P=0.036 5)，見(jiàn)表1。

注：A，適配子聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不同濃度(1，3)-β-D-葡聚糖在450 nm波長(zhǎng)處吸光度的測(cè)定； B，適配子聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不同濃度(1，3)-β-D-葡聚糖的顯色。

圖44種適配子聯(lián)合使用自組裝顯色系統(tǒng)的檢測(cè)性能

注：A，適配子自組裝顯色系統(tǒng)檢測(cè)健康組與DFI組血清中(1，3)-β-D-葡聚糖，DFI組顯著高于健康組(P<0.01)；B，根據(jù)149例血清檢測(cè)結(jié)果擬合出的ROC曲線，由約登指數(shù)計(jì)算適配子自組裝顯色系統(tǒng)本批次檢測(cè)敏感性為98.53%，特異性為88.89%。

圖5適配子自組裝顯色系統(tǒng)對(duì)149份血清的檢測(cè)結(jié)果

表1 適配子自組裝顯色系統(tǒng)與G試驗(yàn)檢測(cè)性能的比對(duì)

3 討論

本研究通過(guò)帶有自顯色系統(tǒng)的核酸配基對(duì)外周血中釋放的真菌細(xì)胞壁(1，3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行檢測(cè)，從而為DFI的輔助診斷提供依據(jù)。(1，3)-β-D-葡聚糖是葡萄糖單體以不同的化學(xué)鍵耦連的聚合體，其在自然界中廣泛存在，而其聚合度和支鏈的不同使其構(gòu)象不一[3]。因此本研究根據(jù)臨床酵母型真菌，尤其是白念珠菌的高感染率[4-5]，選用了白念珠菌ATCC 900291標(biāo)準(zhǔn)菌株，并從中提取了高聚合度的(1，3)-β-D-葡聚糖。

機(jī)體感染酵母型真菌后被吞噬細(xì)胞吞噬消化，細(xì)胞壁(1，3)-β-D-葡聚糖被細(xì)胞內(nèi)的葡聚糖酶消化，高聚合度的葡聚糖被酶切為低聚合度的葡聚糖，從而溶解性也隨之增大并被釋放入體循環(huán)。G試驗(yàn)以循環(huán)中的低聚合度葡聚糖為靶標(biāo)，但G試驗(yàn)的活化并非(1，3)-β-D-葡聚糖特異，其他來(lái)源的葡聚糖均具類(lèi)似功能，甚至是空氣中懸浮的葡聚糖微粒。因此本研究對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁來(lái)源的葡聚糖通過(guò)體外葡聚糖酶消化的方法使之轉(zhuǎn)化為可溶性的低聚合度葡聚糖。針對(duì)低聚合度的(1，3)-β-D-葡聚糖，本研究使用SELEX技術(shù)對(duì)抗體制備較困難的靶標(biāo)篩選核酸配基，該配基具有高特異性、高親和力特點(diǎn)，且易于合成或改造，從而應(yīng)用于不同的場(chǎng)景[6-7]。其核酸的不同折疊構(gòu)象能夠精細(xì)地識(shí)別區(qū)分配體的微小差異，因此本研究利用這一特性，在經(jīng)過(guò)正向負(fù)向篩選后獲得4條識(shí)別(1，3)-β-D-葡聚糖不同位點(diǎn)的高親和力的適配子，并利用G四聯(lián)體結(jié)合hemin后能夠催化TMB顯色的特性[8]：即利用適配子兩端添加G四聯(lián)體互補(bǔ)序列的部分序列，同時(shí)在系統(tǒng)中添加一條完整的G四聯(lián)體序列，在沒(méi)有靶標(biāo)的環(huán)境中，則適配子的5′末端和3′末端添加的序列與G四聯(lián)體序列配對(duì)，形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)，自組裝顯色系統(tǒng)則無(wú)法形成，溶液不變色；當(dāng)有靶標(biāo)時(shí)，適配子形成構(gòu)象與靶標(biāo)結(jié)合，而G四聯(lián)體序列則由于靶標(biāo)的影響無(wú)法與適配子的5′末端和3′末端添加的序列配對(duì)，G四聯(lián)體作為單鏈，其游離則會(huì)與溶液中hemin形成擬過(guò)氧化物酶的特性，進(jìn)而催化底物顯色，從而可以肉眼觀察或酶聯(lián)儀比色定量[8-9]。而針對(duì)靶標(biāo)的不同位點(diǎn)，本研究投入不同的配基，具有一定的放大作用，這對(duì)于低水平物質(zhì)的檢測(cè)不可或缺。同時(shí)DNA的穩(wěn)定性也是其一大優(yōu)勢(shì)，相較蛋白質(zhì)類(lèi)的配基，其效價(jià)穩(wěn)定可控且造價(jià)低廉，對(duì)后期試劑研發(fā)有重要意義。

本研究利用上述顯色系統(tǒng)對(duì)81名體檢健康者和68名DFI患者血清中(1，3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行檢測(cè)，描繪出ROC曲線，根據(jù)約登指數(shù)擬合確定cut off值。由此獲得自建系統(tǒng)敏感性和特異性分別為98.53%和88.89%，高于G試驗(yàn)(敏感性和特異性分別為86.76%和96.29%)。同時(shí)，本研究建立的顯色系統(tǒng)檢測(cè)耗時(shí)為40 min,少于G試驗(yàn)耗時(shí)(90 min)。鑒于本研究是可視化的檢測(cè)手段開(kāi)發(fā)，而(1，3)-β-D-葡聚糖在機(jī)體中的基礎(chǔ)濃度遠(yuǎn)高于我們的檢測(cè)靈敏度，導(dǎo)致其肉眼分辨的界線不明顯，尤其是臨界值的判定。因此我們目前正著手優(yōu)化系統(tǒng)，并輔以比色卡進(jìn)行結(jié)果判讀。

綜上所述，本文利用SELEX技術(shù)篩選了白念珠菌來(lái)源的(1，3)-β-D-葡聚糖的配基，并通過(guò)對(duì)配基改造后能夠自主顯色，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、快速。本研究對(duì)后期深部真菌感染的床旁檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。