超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定舒血寧注射劑中20種黃酮醇苷與萜類內(nèi)酯成分

金高娃，宋春穎，閆競宇，劉艷芳，沈愛金，郭志謀*，梁鑫淼

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，遼寧 大連 116023；2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所-中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，江蘇 泰州 225300)

舒血寧注射劑為銀杏葉提取物制成的滅菌水溶液，主要用于治療缺血性心腦血管疾病、冠心病、心絞痛、腦栓塞、腦血管痙攣等[1-2]，其中起作用的成分為黃酮和萜類內(nèi)酯，每類物質(zhì)均包括多種化合物，如黃酮類包括蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷、楊梅苷、山奈苷、異鼠李苷等；萜類內(nèi)酯包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯等。目前其質(zhì)量控制主要采用液相色譜法，如中國藥典2015版[3]采用紫外檢測法對銀杏提取物中的黃酮類進(jìn)行檢測。但由于對照品的缺乏，通常將黃酮苷類物質(zhì)酸解為黃酮苷元后再進(jìn)行總黃酮醇苷的換算。而對于內(nèi)酯類化合物，由于其無紫外吸收，多采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測。已有檢測方法中，大都將黃酮和萜類內(nèi)酯分開測定，時間較長，溶劑消耗也較大；采用ELSD檢測時靈敏度低、重復(fù)性差；由于標(biāo)準(zhǔn)品缺乏，中國藥典2015版規(guī)定銀杏提取物中總黃酮醇苷不得少于24.0%，萜類內(nèi)酯不得少于6.0%；衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑中規(guī)定舒血寧注射劑5 mL規(guī)格含總黃酮醇甙4.2 mg，均規(guī)定的總量，但這并不能全面代表注射劑的性質(zhì)，不同注射劑即使黃酮總量相近，但各單個黃酮苷的含量可能差異較大。為避免添加某種黃酮苷元使產(chǎn)品質(zhì)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)展舒血寧注射劑中多種有效成分同時測定的方法具有重要意義。

為解決黃酮和萜類內(nèi)酯化合物同時檢測的問題，發(fā)展通用檢測器如蒸發(fā)光散射(ELSD)[4]、電噴霧(CAD)[5]、質(zhì)譜(MS)[6]等方法是較可行的途徑。對于多種物質(zhì)的同時定量，采用ELSD及CAD等檢測器時，需達(dá)到基線分離才能準(zhǔn)確定量。而采用質(zhì)譜檢測時，對于保留時間相同的化合物，只要定量離子對不同，即可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。目前已有采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定銀杏提取物中化合物的文獻(xiàn)報道，如張?zhí)m桐等[7]采用HPLC-MS法同時測定了舒血寧注射液中的4種萜類內(nèi)酯和3種黃酮苷元;丁宏等[8]采用UPLC-Q/Orbitrap-HRMS鑒別和定量了含銀杏葉提取物保健食品中的5種萜類內(nèi)酯和3種黃酮醇，但樣品仍需酸解后再進(jìn)行測定。除黃酮苷元的定量分析外，胡蓉蓉等[9]建立了UPLC-MS/MS測定銀杏葉提取物中10個黃酮類成分的分析方法；吳惠勤等[10]建立了銀杏保健茶中16種黃酮類物質(zhì)的LC-MS/MS方法，16種黃酮類化合物均為黃酮苷元，樣品也需酸解后測定。除此之外，Bi等[11]發(fā)展了兩步液液萃取的前處理方法，采用UPLC-MS/MS研究了銀杏制劑中的3種黃酮苷元和4種萜類內(nèi)酯在小鼠血漿中的藥代動力學(xué)。孫毓慶[12]及蘇薇薇[13]等的研究表明，銀杏制劑中含有較多物質(zhì)，并采用LC-MS方法分別鑒定了銀杏葉提取物中的12個黃酮醇苷和30個黃酮類化合物。對每個黃酮苷的定量更能反映出銀杏制劑的質(zhì)量，Cheng等[14]采用UPLC-MS/MS定量分析了銀杏葉提取物中的4個黃酮醇苷、5個黃酮苷元、5個萜類內(nèi)酯及2個銀杏酸；Guo等[15]采用UPLC-QTOF-MSE測定了銀杏葉提取物中包括17種黃酮醇苷和5種萜類內(nèi)酯在內(nèi)的33個化合物，有利于更進(jìn)一步的銀杏葉提取物及制劑的質(zhì)量研究。

因受限于黃酮醇苷類化合物對照品的缺乏，對銀杏制劑中黃酮醇苷的定量研究尚不深入，本課題組前期自主制備得到了銀杏葉提取物中的16種黃酮醇苷化合物和4種萜類內(nèi)酯，以這些物質(zhì)為對照品，建立了UPLC-MS/MS方法同時定量舒血寧注射液中20種黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯的分析方法。該方法前處理簡單、快速靈敏且重復(fù)性好，適用于舒血寧注射劑的質(zhì)量研究。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters UPLC Acquity UPLC I-CLASS超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配自動進(jìn)樣器、高壓二元溶劑管理器、柱溫箱和Masslynx工作站；質(zhì)譜儀為Waters Xevo TQ-XS(美國Waters公司)。

甲酸(色譜級，北京百靈威科技有限公司)；乙腈和甲醇(色譜純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)；實(shí)驗用水由Milli-Q超純水機(jī)(美國密理博有限公司)制備。

槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、楊梅素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-對香豆?；咸烟鞘|香糖苷、萬壽菊素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、丁香黃素-3-O-蕓香糖苷、3’,5’-二甲氧基楊梅素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷、槲皮素-3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒?、山奈酚-3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒?、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯均為自主制備，HPLC純度>95%。舒血寧注射劑購于大連沙河口星海灣富國社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件色譜柱:Acquity UPLC BEH Shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流動相:A為0.1%甲酸，B為乙腈，梯度洗脫程序:0～10 min，12%～38% A；流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式，毛細(xì)管電壓3.10 kV，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h，進(jìn)樣錐氣體流速150 L/h。選取Q1質(zhì)量數(shù)為母離子，Q3質(zhì)量數(shù)為子離子進(jìn)行定量分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取16種黃酮醇苷和4種萜類內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液配成質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL單標(biāo)儲備液。取各單標(biāo)儲備液適量于同一容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容。使用時逐級稀釋配成0.005 ～40 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

各舒血寧注射劑采用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液稀釋20倍，定容、備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗條件優(yōu)化

在電噴霧離子源正、負(fù)模式下均進(jìn)行了舒血寧注射劑樣品的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萜類內(nèi)酯化合物在負(fù)模式下的響應(yīng)較正模式強(qiáng)，而黃酮類化合物在正、負(fù)模式下均有響應(yīng)，因此實(shí)驗采用負(fù)離子模式進(jìn)行20種化合物的質(zhì)譜檢測，并通過Masslynx軟件自動優(yōu)化各化合物多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下的錐孔電壓(CV)和碰撞能(CE)。流動相采用乙腈-水，在水相中加入適量甲酸可改善黃酮醇苷類化合物的峰形[14-16]，通過優(yōu)化流動相比例，使各化合物定量時無干擾，且保留時間相同的化合物具有不同的定量離子對，并可在10 min內(nèi)完成舒血寧樣品中20種待測物的分析，完全滿足定量要求。優(yōu)化條件下的20種黃酮和萜類內(nèi)酯化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1，MRM譜圖見圖1。

表1 20種目標(biāo)化合物的保留時間(RT)、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子對、錐孔電壓(CV)和碰撞能(CE)

(續(xù)表1)

No.CompoundRetentiontime/minMRMtransitions(m/z)CV/VCE/eV133’,5’-Dimethoxymyricetin-3-O-rutoside(3’,5’-二甲氧基楊梅素-3-O-蕓香糖苷)5.88653.3>345.1?,653.3>330.0100,10040,3014Kaempferol-3-O-2”-glucosylrhamnoside(山奈酚-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷)6.56593.2>284.1?,593.2>255.198,9834,5615Quercetin-3-O-p-coumaricglucosylrhamnoside(槲皮素-3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒?7.90755.2>300.0?,755.2>609.3100,10044,3016Kaempferol-3-O-p-coumaricglucosylrhamnoside(山奈酚-3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒?8.66739.3>284.1?,739.3>593.3100,10046,3017GinkgolideA(銀杏內(nèi)酯A)7.03407.2>319.2?,407.2>335.262,6214,1418GinkgolideB(銀杏內(nèi)酯B)7.09423.2>367.2?,423.2>125.028,2814,2819GinkgolideC(銀杏內(nèi)酯C)4.42439.2>383.2?,439.2>125.030,3014,3420Bilobalide(白果內(nèi)酯)5.07325.2>163.1?,325.2>193.130,3020,12

*：quantitative ion pair

圖1 20種化合物的UPLC-MS/MS MRM譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量下限配制20種化合物質(zhì)量濃度為0.005 ～ 40 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下測定，以各待測物的定量離子對峰面積(y)對其相應(yīng)質(zhì)量濃度(x,μg/mL)進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限(LOD)，以S/N=10確定方法的定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，20種待測物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)不小于0.963 3，LOD為0.02～1.59 ng·mL-1，LOQ為0.07～5.30 ng·mL-1。20種待測物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限結(jié)果見表2。

表2 20種待測物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

the numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2.2 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取舒血寧注射劑在稀釋前分別加入一定量16種黃酮醇苷和4種萜類內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成低、中、高3個質(zhì)量濃度的加標(biāo)溶液，每個濃度平行3個，在優(yōu)化條件下測定，計算方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,20種化合物的平均回收率為85.9%～109%，RSD不高于9.5%(表3)，表明方法的結(jié)果可靠且符合分析要求。

表3 舒血寧注射劑中20個化合物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

*recovery=(found-background)/added×100%；the numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2.3 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性采用質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的20種待測物混合對照品溶液，采用本方法在優(yōu)化條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計算20種化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，并連續(xù)測定3 d。結(jié)果顯示，20種待測物的日內(nèi)RSD(n=6)及日間RSD(n=18)分別為0.65%～4.8%和1.5%～6.5%，表明儀器性能良好，重現(xiàn)性高。取6份舒血寧注射劑樣品分別稀釋20倍后測定，計算得20種化合物峰面積的RSD為0.62%～4.6%(該樣品中不含白果內(nèi)酯)，表明方法的重復(fù)性良好。樣品配制后，分別在室溫下放置2、4、8、18、24 h進(jìn)行測定，得20種目標(biāo)物峰面積的RSD為0.93%～8.6%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 實(shí)際樣品測定

采用本方法對4個廠家(標(biāo)記為A～D)的舒血寧注射劑樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。不同廠家的樣品中各化合物的含量差異較大，A、B廠家產(chǎn)品中的槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷含量較C、D廠家稍高。C廠家產(chǎn)品中槲皮素-3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒铡⑸侥畏?3-O-對香豆?；咸烟腔罄钐擒铡y杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯含量較高。A廠家產(chǎn)品中不含白果內(nèi)酯，B廠家產(chǎn)品中白果內(nèi)酯含量極低。A和D廠家產(chǎn)品的總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的含量相當(dāng)，但各化合物的含量存在明顯差異，因此有可能帶來不同的療效。由此可見，對舒血寧產(chǎn)品中各化合物的定量分析可為其質(zhì)量控制提供新思路。

表4 不同廠家舒血寧注射劑樣品中20個化合物的定量結(jié)果(n=3)

-:no data;the numbers denoted were the same as those in Table 1

3 結(jié) 論

本文建立了舒血寧注射劑中16個黃酮醇苷和4個萜類內(nèi)酯同時定量的UPLC-MS/MS分析方法。相比傳統(tǒng)酸解定量黃酮苷元及黃酮、內(nèi)酯的方法，本方法可在10 min內(nèi)完成樣品中20種化合物的同時測定，方法簡單快速、重現(xiàn)性好，適于舒血寧注射劑中多種黃醇酮苷和萜類內(nèi)酯的同時定量，為其深入的質(zhì)量研究奠定了基礎(chǔ)。