基于高通量測序技術的兩種水螅水母現(xiàn)場食物研究

徐盛楠,孫婷婷,彭賽君,張建設,董志軍,3

(1.浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站，山東 煙臺 264003；3.中國科學院海洋大科學研究中心,山東 青島 266071)

水母以攝食量高、生長速度快、食物來源廣泛等特征，在海洋食物網(wǎng)中占有十分重要的地位[1]。近年來，水母暴發(fā)事件頻發(fā)，已成為近岸海域典型的海洋生態(tài)災害[2-3]。暴發(fā)的水母類需要消耗大量食物，比如浮游生物、魚蝦貝類幼體等，而激增的攝食量對被攝食者的種群數(shù)量和分布都具有不可忽視的影響。同時，水母又可被多種生物類群攝食，企鵝(Spheniscus)、銀鯧(Pampusasgenteus)、綠鰭馬面鲀(Navodonseptentrionalis)以及大型海龜棱皮龜(Dermochelyscoriacea)等生物類群都會攝食一定數(shù)量的水母作為其能量補充[4-7]。因此，進行水母類的攝食研究對探究水母在海洋食物網(wǎng)中的物質(zhì)循環(huán)及能量流動的地位具有重要意義。

目前，國內(nèi)外學者對水母類攝食已有較多研究[8-12]，采用的方法主要包括直接鏡檢法、腸道色素法、脂肪酸標記法和同位素標記法。其中，直接鏡檢法是最常見的生物食性檢測方法，但該方法難以從海洋生物胃腔中鑒定半消化食物種類，同時，攝入的食物種類通常缺乏清晰的分類學診斷特征，不適用于個體較小生物的食物種類鑒定[13-14]；腸道色素法只能測定含有色素的植物攝食物，無法有效測定不含色素的動物及其碎屑[15]；脂肪酸標記法可以揭示食物網(wǎng)中的物質(zhì)流動，定量分析各類食物來源對攝食者的食物貢獻程度，但易受到生物特定脂肪酸在空間和時間上的變化[16]、特定脂肪酸在捕食者體內(nèi)的變化[17]及脂肪酸的降解[18]等因素的限制；同位素標記法能夠以碳氮同位素在生物之間的穩(wěn)定富集作用來揭示捕食者的食物組成，但該方法在復雜的食物網(wǎng)中難以獲得更為準確的食物種類結果[19]。

高通量測序技術(High-throughput DNA Sequencing Technique)是現(xiàn)代分子生物學最重要的分析方法之一，具有信息量大、靈敏度高、成效快、成本低等優(yōu)勢，越來越廣泛地應用于生物多樣性的研究[20]。目前，高通量測序技術已被應用于魚類和龍蝦幼體等海洋生物的攝食多樣性研究中，揭示了豐富的攝食生物多樣性[21-24]。本研究利用高通量測序技術來研究管花薩氏水母(Sarsiatubulosa)和八斑芮氏水母(Rathkeaoctopunctata)這兩種我國北方近海沿岸水域常見的水母種類的現(xiàn)場食物組成，為快速準確地檢測水母類現(xiàn)場食物組成提供新的技術方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

2018年4月，于威海榮成近岸海域(36.934°N，122.419°E)采用淺水Ⅰ型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)口直徑50 cm，篩絹孔徑0.505 mm)拖網(wǎng)采集管花薩氏水母和八斑芮氏水母，分裝于15 cm3的滅菌離心管中，并加入2%的中性魯哥氏液，避光保存。每個離心管中放置30只管花薩氏水母，共12個樣品；10只八斑芮氏水母，共12個樣品，總計24個樣品?，F(xiàn)場固定的水母樣品帶回實驗室后，4 ℃下避光保存。DNA提取前，使用經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的無菌海水清洗樣品表面2～3次，并在OLYMPUS SZX10體視顯微鏡下觀察，確保清洗之后的管花薩氏水母和八斑芮氏水母表面無其他生物或碎屑附著，處理好的樣品吸干水分后，轉(zhuǎn)移到1.5 cm3的滅菌離心管中，每個離心管放置1只水母樣品。

1.2 樣品DNA提取

將兩種水母樣品置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍30 min，用滅菌過的杵棒充分研磨樣品。加入500 mm3DNA裂解液，于恒溫水浴鍋中55 ℃水浴48 h，樣品總DNA提取后，使用GeneJET Gel Extraction Kit純化試劑盒對DNA樣品進行純化，純化后的DNA樣品冷凍保存于-20 ℃冰箱。

1.3 PCR擴增、文庫構建與高通量測序

使用帶Barcode特異引物的18S V4區(qū)528F-706R為引物對提取的DNA進行PCR擴增。引物序列：528F：5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′；706R：5′-GCCTTGCCAGCCCG ATCAGAATCCRAGAATTTCACCTCT-3′。30 mm3的反應體系包括15 mm3Phusion Master Mix，3 mm3引物，10 mm3DNA 和2 mm3ddH2O。在Bio-rad T100梯度PCR儀上進行PCR擴增反應：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃保溫5 min。使用GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)純化PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等質(zhì)量混樣操作，充分混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp的序列，割膠回收目標條帶。使用Illumina公司Truseq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測，合格后在Illumina HiSeq PE250平臺上對文庫進行測序，并產(chǎn)生300 bp的配對末端讀數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對測序所得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)進行拼接和過濾，獲取有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。利用獲得的有效數(shù)據(jù)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析，將所得物種18S rDNA的序列在GeneBank上找到對應的物種，利用MEGA 6.0軟件構建Neighbor-joining(N-J)生物系統(tǒng)進化樹進行聚類分析，利用SPSS 19.0軟件對水母的各門類和綱類攝食物種進行對比分析，得到兩種不同水母的攝食結構。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

由Illumina HiSeq PE250平臺測序后，本研究共獲得原始序列2 188 641段，經(jīng)拼接和過濾后得到有效序列為2 124 548段，共篩選有用信息共34個OTUs用于進一步分析。管花薩氏水母和八斑芮氏水母的具體食物組成及占比具體見表1。

表1 管花薩氏水母和八斑芮氏水母食物組成及占比

續(xù)表1

兩種水螅水母共鑒定出34種食物種類，其中管花薩氏水母食物種類為31種，包括刺胞動物門、節(jié)肢動物門、端復胞器門、纖毛門等16個門類，顎足綱、缽水母綱、孢子蟲綱、寡膜綱等25個綱類。管花薩氏水母現(xiàn)場攝食食物的主要門類組成為節(jié)肢動物門和刺胞動物門，分別占其食物來源的66.29%和30.76%(圖1)；主要的綱類組成為顎足綱、水螅水母綱和缽水母綱，分別占其食物來源的66.28%、26.58%和4.16%(圖2)。管花薩氏水母主要的食物種類是太平真寬水蚤(Eurytemorapacifica)和八斑芮氏水母，二者分別占到其食物來源的45.14%和26.42%(表1)。

八斑芮氏水母共鑒定出29種食物種類，包括節(jié)肢動物門、刺胞動物門、扁形動物門、纖毛門等16個門類，顎足綱、水螅水母綱、缽水母綱、被桿體綱等23個綱類。八斑芮氏水母現(xiàn)場攝食食物的主要門類組成同樣為節(jié)肢動物門和刺胞動物門，分別占69.63%和29.44%(圖3)；主要的綱類組成為顎足綱、水螅水母綱和缽水母綱，分別占69.59%、21.79%和7.31%(圖4)。八斑芮氏水母主要的食物種類是太平真寬水蚤和管花薩氏水母，分別占42.42%和21.75%(表1)。

圖1 管花薩氏水母現(xiàn)場攝食食物種類的主要門類占比

圖2 管花薩氏水母現(xiàn)場攝食食物種類的主要綱類占比

圖3 八斑芮氏水母現(xiàn)場攝食食物種類的主要門類占比

圖4 八斑芮氏水母現(xiàn)場攝食食物種類的主要綱類占比

基于18S rDNA，使用鄰接法構建的Neighbor-joining(N-J)生物系統(tǒng)進化樹(圖5)，對管花薩氏水母和八斑芮氏水母的現(xiàn)場攝食食物進行的聚類分析發(fā)現(xiàn)，兩者的共同攝食種類包括海月水母(Aureliacoerulea)、太平真寬水蚤、紡錘水蚤(Acartiasp.)、近緣真寬水蚤(Eurytemoraaffinis)等26種食物，其中橈足類為4種，且該類群在管花薩氏水母和八斑芮氏水母的攝食食物組成中占有很高的比例，分別為66.28%和69.59%。管花薩氏水母獨有的攝食食物種類包括八斑芮氏水母、粘蟲(Mythimnaseparata)、小麥(Triticumaestivum)、黑色附球菌(Epicoccumnigrum)和鏈格孢菌(Alternariaalternata)5種，而八斑芮氏水母獨有的攝食食物種類則包括管花薩氏水母、精致針刺水蚤(Euchaetaconcinna)和微胞藻(Micromonassp.RCC830)3種。

2.2 討論

研究結果表明，管花薩氏水母和八斑芮氏水母現(xiàn)場攝食食物種類具有較高的多樣性。管花薩氏水母攝食食物種類31種，涉及節(jié)肢動物門、刺胞動物門、端復胞器門等16個門類，顎足綱、水螅水母綱、缽水母綱等25個綱類；八斑芮氏水母攝食物種類29種，涉及節(jié)肢動物門、刺胞動物門、扁形動物門等16個門類，顎足綱、水螅水母綱、缽水母綱等23個綱類，攝食種類多樣，門類廣泛。水母的廣食性，在本研究中再一次得到了證實，在之前的對水母攝食的研究中，已有研究學者提出此觀點。Purcell等(2003)在對海月水母、獅鬃水母(Cyaneacapillata)和多管水母(Aequoreaaequorea)3種大型水母的攝食研究中發(fā)現(xiàn)，橈足類、橈足類幼體和枝角類都是它們的主要攝食對象[25]。陳麗華等(2003)發(fā)現(xiàn)港球側(cè)腕水母(Pleurobrachiaglobosa)可攝食長尾類幼體、短尾類幼體、蔓足類無節(jié)幼體、橈足類和端足類等多種生物種類[9]。Riascos等(2016)發(fā)現(xiàn)在大型缽水母Chrysaoraplocamia的攝食物種中魚卵、魚幼體和甲殼類浮游動物均占較大比例，約52.4%～99.3%[26]。Underwood等(2007)在伊魯坎吉水母(Carukiabarnesi)腸道中發(fā)現(xiàn)了魚卵、魚類的幼體和節(jié)肢動物門的動物[11]。由此可見，水母的攝食食物種類多樣，且來源廣泛。

圖5 基于18S rDNA構建Neighbor-joining(N-J)生物系統(tǒng)進化樹

管花薩氏水母和八斑芮氏水母的的主要食物來源均為節(jié)肢動物門、顎足綱，主要食物種類均為橈足類的太平真寬水蚤。Pagès等(1996)對藪枝水母(Obeliaspp.)和八斑芮氏水母的胃含物的檢測，以擬長腹劍水蚤(Oithonasimilis)和諾氏三角溞(Evadnenordmanni)兩種橈足類生物為主要的攝食物種[27]，與本研究得出的主要攝食的橈足類種類不同，推測可能是由于水母所處海域環(huán)境不同，橈足類優(yōu)勢種存在差異造成的。在Arai(1997)對霞水母(Cyaneasp.)和口冠水母(Stomolophusmeleagris)的胃含物的分析研究中，同樣發(fā)現(xiàn)橈足類是其攝食的主要食物類群[28]。因此，橈足類是水母類的重要食物來源。

本研究發(fā)現(xiàn)，管花薩氏水母和八斑芮氏水母的攝食食物除浮游動物外，還包括少量真菌、浮游植物。在管花薩氏水母的攝食物種中發(fā)現(xiàn)了枝孢菌(Cladosporiumsp.)、清酒假絲酵母(Candidasake)、黑色附球菌、鏈格孢菌和限制性馬拉色菌(Malasseziarestricta)5種真菌以及條紋脆桿藻(Grammonemastriatula)和海鏈藻(Thalassiosiraguillardii)2種藻類；在八斑芮氏水母的攝食物種中發(fā)現(xiàn)了枝孢菌、清酒假絲酵母和限制性馬拉色菌3種真菌以及微胞藻、條紋脆桿藻和海鏈藻3種藻類。因此，管花薩氏水母和八斑芮氏水母均屬于雜食性。本研究發(fā)現(xiàn)水母攝食組成中含有真菌和浮游植物并非偶然，曾有學者提到前寒武紀時期，在較大型的浮游生物出現(xiàn)之前刺胞動物會攝食真菌和藻類[29]。馬喜平等(1998)認為水母會選擇性地攝食一些浮游植物和有機碎屑來補充其能量需求[30]。然而真菌和浮游植物與水母之間的營養(yǎng)關系還存在其他可能。真菌在沿海水域極為豐富，通常附著于浮游植物、浮游顆粒和有機聚集體上或以自由形式存在[31]。眾多研究發(fā)現(xiàn)橈足類的現(xiàn)場攝食食物中含有枝孢菌、馬拉色菌(Malassezia)和短梗霉菌(Aureobasidium)，但它們與海洋橈足類之間的營養(yǎng)關系并沒有得到肯定[32-33]。Riemann等(2010)在歐洲鰻(Anguillaanguilla)腸道含物的DNA檢測中發(fā)現(xiàn)真菌序列，但考慮到與其他海洋生物間的相互作用，并無法確定二者之間的捕食關系[34]。同理，水母和真菌之間的攝食和營養(yǎng)關系同樣也需要進一步研究。此外，在本研究中管花薩氏水母和八斑芮氏水母對浮游植物的攝食比例較小，所攝食的浮游植物以硅藻類占比較大，且硅藻類浮游植物是橈足類攝食的主要食物類群，而橈足類又是管花薩氏水母和八斑芮氏水母主要的攝食物種，由此我們推測成體管花薩氏水母和八斑芮氏水母可能并非直接攝食浮游植物，而是在攝食橈足類時將其體內(nèi)未消化的浮游植物碎屑一同攝入體內(nèi)。

研究結果中管花薩氏水母和八斑芮氏水母的攝食食物種類中還含有少量的陸地植物碎屑，包括構樹(Broussonetiapapyrifera)、小麥、菜心(Brassicarapa)和大豆(Glycinemax)4種。這4種陸地植物為當?shù)氐某Ｒ娢锓N，且在采樣時間內(nèi)較為豐富，因此，可能成為水母攝食的一部分。但無法確定管花薩氏水母和八斑芮氏水母是直接攝食陸生植物(碎屑)以維持其食物攝入量作為能量補充，還是由于攝食的橈足類體內(nèi)含有未被消化的陸生植物碎屑而間接進入水母體內(nèi)。有研究者認為，當存在異養(yǎng)微生物時，陸地植物的花粉可以刺激浮游動物的生長[35]，除花粉碎屑外，其他類型的陸地植物碎屑也會成為浮游動物攝食的一部分[36-37]。胡思敏等(2015)的研究發(fā)現(xiàn)陸地植物在橈足類攝食食物中占據(jù)一定比例[33]。由于目前尚未見對水母攝食陸地植物和相關物種的研究報道，因此，我們需進行進一步的現(xiàn)場或室內(nèi)攝食實驗分析來了解沿海生態(tài)系統(tǒng)中不同生物之間的攝食及營養(yǎng)關系，以確定陸地植物的營養(yǎng)價值和對水母攝食的貢獻作用。

管花薩氏水母和八斑芮氏水母互為捕食對象，且在雙方食物比重中的占比較高。管花薩氏水母攝食八斑芮氏水母的比例占總攝食食物比例的26.42%，八斑芮氏水母攝食管花薩氏水母的比例也達到了21.75%。除此之外，二者還均攝食海月水母等其他水母種類。水母相互捕食的現(xiàn)象并非個例，Hansson等(1997)發(fā)現(xiàn)獅鬃水母會捕食海月水母以及其他水母[38]，馬喜平等也曾在其研究中指出水母類之間的捕食現(xiàn)象較為普遍[30]。

3 結論

本研究利用高通量測序的方法對管花薩氏水母和八斑芮氏水母的現(xiàn)場食物組成進行了研究，對兩種水母的攝食結構進行了系統(tǒng)的討論。其研究結果表明：

(1)管花薩氏水母和八斑芮氏水母的的攝食食物種類具有多樣性，管花薩氏水母攝食種類為31種，涉及16個門類、25個綱類；八斑芮氏水母攝食種類為29種，涉及16個門類、23個綱類。

(2)兩種水母從攝食物種上看屬于雜食性，其食物組成包括浮游動物、真菌、浮游植物、陸地植物碎屑等。

(3)管花薩氏水母和八斑芮氏水母二者互為捕食對象。

(4)二者的攝食結構具有相似性，共包含26種相同的攝食物種，且均以節(jié)肢動物門和顎足綱的食物類群為主，以太平真寬水蚤為優(yōu)勢種。