貴州地區(qū)HCV感染者基因型分布特征

王 梅， 楊興林， 張 流， 王 軍， 王 藝

貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 a.肝病科； b.檢驗(yàn)科，貴陽 550004

HCV為黃病毒科肝炎病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全基因組約9.6 kb。根據(jù)全基因組核苷酸序列的差異性及Simmonds分型系統(tǒng)，可將HCV分為6種基因型和80多種不同亞型[1-2]。隨著核苷酸測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，HCV序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步擴(kuò)大，使用共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)可將HCV分為7個(gè)確認(rèn)基因型和67個(gè)亞型以及21個(gè)待定的基因亞型[3]。由于HCV基因型與肝病進(jìn)展及干擾素或直接抗病毒藥物(DAA)抗病毒療效的關(guān)系密切，因此HCV基因分型對(duì)丙型肝炎的防控具有重要意義。但隨著主要傳播途徑的改變及各地人員流動(dòng)性的增加，近年來全國多數(shù)地區(qū)對(duì)HCV感染者流行病學(xué)調(diào)查表明HCV基因型分布已發(fā)生改變。本研究采用RT-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，對(duì)貴州地區(qū)HCV感染者進(jìn)行基因分型，旨在分析該地區(qū)HCV流行株的基因型，及不同基因型在傳播途徑、性別、年齡、民族中分布的差異性，為HCV感染的防控和臨床個(gè)體化治療提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年9月-2018年10月本救治中心門診及住院的HCV RNA>500 IU/ml患者，根據(jù)《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。本研究經(jīng)貴陽市公共衛(wèi)生救治中心倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 血清標(biāo)本收集 抽靜脈血3 ml，離心后取血清1.0 ml用eppendor離心管分裝，-80 ℃保存標(biāo)本，采樣同時(shí)收集患者臨床資料。

1.3 HCV基因型檢測(cè)

將已確定HCV RNA>500 IU/ml的標(biāo)本通過逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR擴(kuò)增C基因羧基端至E1基因氨基端長(zhǎng)度為474 bp的片段，測(cè)定其核苷酸序列，與GenBank中已知的HCV序列進(jìn)行系譜分析，確定HCV基因型及亞型。

1.3.1 引物合成 根據(jù)已公布的序列，于HCV Core-E1區(qū)核苷酸序列合成2對(duì)引物(由上海生工公司合成)，引物序列：CEI-ESP(正向) 5′-GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC-3′(834-859位核苷酸)；CEI-EAP(反向) 5′-CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT-3′(1328-1305位核苷酸)；CEI-ISP(正向) 5′-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3′(502-527位核苷酸)；CEI-IAP(反向) 5′-GTTCATCATCATATCCCATGCCAT-3′。

1.3.2 HCV RNA提取 采用Qiagen公司QIAamp viral RAN mini kit提取RNA：用異硫氰酸胍Trizol-氯仿-異丙醇提取血清中的HCV RNA，75%的乙醇洗滌RNA沉淀，15 μl DEPC水溶解核酸后于-70 ℃保存或水浴備用。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 逆轉(zhuǎn)錄及首輪PCR同時(shí)進(jìn)行，反應(yīng)體系50 μl。反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，得到外擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。取2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR，循環(huán)參數(shù)與第1輪PCR相同，最終得到內(nèi)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，片段474 bp。產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，通過凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。將陽性PCR產(chǎn)物用Promega的PCR DNA純化體系進(jìn)行純化后，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，CE1-ISP為測(cè)序引物。所得序列用DNALASER 7.1.0進(jìn)行HCV亞型鑒別。

參考序列取自美國國立生物技術(shù)信息中心：1a AF271632、1b D90208、2a D00944、2b D10988、3a D17763、3b D49374、4a Y11604、5a Y13184、6a Y12083、6b D84262、6d D84236、6e EU246931、6k D84264、6n DQ278894、6v EU798761。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入HCV RNA>500 IU/ml患者1211例，其中男767例，女444例，年齡6～84歲，平均(40.54±9.95)歲。1211例患者中漢族946例，苗族80例，土家族57例，布依族56例，侗族30例，蒙古族2例，彝族13例，水族9例，穿青族7例，仡佬族5例，回族4例，黎族1例，白族1例；貴陽市647例，遵義市27例，銅仁市108例，黔西南39例，黔南106例，黔東南46例，六盤水市32例，畢節(jié)市152例，安順市54例。

2.2 HCV基因型和基因亞型 1211例樣本共檢出4種基因型、11種基因亞型，貴州地區(qū)HCV感染者基因流行株以1b、3b、6a型為主，同時(shí)檢測(cè)出 HCV 6型中的多種少見亞型。非1型占比明顯高于1型(70.85% vs 29.15%，χ2=210.59，P<0.001)(表1)。

2.3 比較不同性別、年齡、地區(qū)、傳播途徑中HCV基因型分布的差異

2.3.1 不同性別中HCV基因型分布特點(diǎn) 1211例患者中男性占63.33%(767/1211)，女性占36.67%(444/1211)。因6d、6k、6e、6n、6v型樣本例數(shù)過少，故與6a型合并，按6型分析。結(jié)果顯示，1a、1b、2a、3a、3b、6型這6種基因型在男女患者中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.428，P=0.009)；男性感染者中3b型所占比例最高，而女性中1b型所占比例最高(表2)。

表1 HCV基因型和基因亞型構(gòu)成比

2.3.2 不同年齡組中HCV基因型分布特點(diǎn) 按年齡進(jìn)行分組，分析不同年齡組感染者的基因型分布。結(jié)果顯示，不同年齡組中各種HCV基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.439，P<0.001)。其中低年齡組(≤18歲)和高年齡組(≥60歲)以1b型為主，分別為66.67%(4/6)和58.93%(33/56)；19～39歲組以3b、6型為主；40～59歲組以1b、3b及6型為主(表3)。

2.3.3 不同民族中HCV基因型分布特點(diǎn) 分析結(jié)果顯示，不同HCV基因型在民族間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.776，P=0.316)(表4)。

2.3.4 不同地區(qū)中HCV基因型分布特點(diǎn) 貴陽地區(qū)以1b、3b和6型為主，3a型次之；遵義、黔西南、黔東南、畢節(jié)、黔南地區(qū)以1b型為主，6型次之；六盤水地區(qū)以1b型為主，3b型次之；銅仁地區(qū)以3b型為主，6型次之；安順地區(qū)以3b型為主，1b、3a型分布比例相同。各地區(qū)HCV基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.279，P=0.349)(表5)。

2.3.5 不同感染途徑中HCV基因型分布特點(diǎn) 1211例患者中靜脈藥癮(吸毒)702例， 手術(shù)外傷史(包括牙科治療)75例，有創(chuàng)美容史102例，輸血或血液透析史90例，與HCV患者性接觸史102例，母嬰傳播6例，不明原因感染者129例，此外有5例職業(yè)暴露者。各種感染途徑的HCV基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=153.916，P<0.001)；1b型主要見于經(jīng)輸血途徑感染，經(jīng)靜脈藥癮和有創(chuàng)美容感染HCV者以3b型為主，性接觸HCV感染者以6型為主(表6)。

3 討論

HCV感染是世界范圍內(nèi)慢性肝病的主要原因之一[5]，感染后起病隱匿，慢性化程度高，是導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要病因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球約有1億8000萬人感染HCV，其中7100萬慢性感染者[5]。HCV在世界不同地區(qū)的分布有很大差異，由于病毒的高度異質(zhì)性，其基因型分布也具有明顯的地域差異。一項(xiàng)分析包括1217項(xiàng)HCV基因型研究[6]數(shù)據(jù)表明：HCV基因1型仍是主要流行的基因型，約8340萬例(占HCV感染者的46.2%)，在東亞地區(qū)，基因1型約占所有基因型的1/3；其次為基因3型，約5430萬例，占30.1%；基因2、4和6型共為22.8%；基因5型小于1%；85個(gè)國家基因1型最常見，主要是南美洲及北美洲國家，美國、墨西哥以1a型為主，其次是1b型；基因2型在非洲西部最常見；基因3型在南亞和斯堪的納維亞半島部分地區(qū)較常見；基因4型在非洲中部、北部常見；基因5型在南非最常見。近期有學(xué)者[7]于印度發(fā)現(xiàn)基因8型的存在，在中非分離出基因7型[8]。同時(shí)分析[6]提示，中國和許多東南亞國家以及西歐和澳大利亞的基因型分布多樣性較高。我國主要流行的HCV基因型為1、2、3和6型，其中以1b型為主(56.8%)，其次為2型(24.1%)和3型(9.1%)，6型相對(duì)較少(6.3%)[4]。此外，南北分布存在一定的差異性，北方地區(qū)以1b、2a為主，而南方地區(qū)基因型種類較多，分布呈多樣性，以1b型為主，2a、3a、3b及6a各占較大比例[9]。貴州地區(qū)HCV基因型分布亦體現(xiàn)了這一特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)HCV基因型有：1a、1b型，2a型，3a 、3b型，6a、6d、6e、6k、6n、6v型。其中主要流行株為3b、1b、6a型，其次為3a型；非1型占70.85%，明顯高于1型(29.15%)，這與國內(nèi)報(bào)道的總體流行趨勢(shì)不同[4]，與哈爾濱等北方地區(qū)報(bào)道的流行情況[10]差異較大，但與近幾年西南地區(qū)流行株主要為1b和3b的報(bào)道[11-12]相近。然而本研究與貴州地區(qū)以往流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[13-14]有所不同，3b和6型占比明顯增加，可能的原因有：(1)樣本量較以往研究多，研究對(duì)象不僅僅是單純的慢性丙型肝炎患者。隨著DAA的應(yīng)用，失代償期肝硬化、毒癮未戒斷、甲亢等干擾素治療禁忌的患者就診率明顯增加也是原因之一；(2)更可能的因素是與近幾年流動(dòng)人口增加、生活方式改變導(dǎo)致不同感染途徑比例的變化有關(guān)。

表2 不同性別HCV基因型分布[例(%)]

表3 不同年齡組HCV基因型分布[例(%)]

表4 不同民族HCV基因型分布[例(%)]

注：其他民族包含侗族、蒙古族、彝族、水族、穿青族、仡佬族、回族、黎族、白族。

表5 不同地區(qū)HCV基因型分布[例(%)]

表6 不同感染途徑HCV基因型分布[例(%)]

以往報(bào)道輸血、靜脈藥癮者和手術(shù)是我國HCV流行的主要危險(xiǎn)因素[15]，但近年來，隨著國家對(duì)采供血機(jī)構(gòu)及血源的嚴(yán)格管控和獻(xiàn)血人員的積極篩查，經(jīng)輸血或單采血漿等方式感染HCV的比例明顯下降；但隨著靜脈藥癮者增多、生活方式的改變，因吸毒、性接觸、有創(chuàng)美容等方式感染HCV的人數(shù)逐漸增加。在本次調(diào)查中，因靜脈藥癮感染HCV的比例最高(57.97%)，其次為性接觸(8.42%)和有創(chuàng)美容(8.42%)。HCV基因型分布格局也隨之改變。HCV基因3型和6型主要在靜脈藥癮者中流行，在廣東及中國香港的靜脈藥癮者中HCV基因型以6a型為主[16-17]；而3a和3b亞型是上海浦東吸毒者中HCV感染的主導(dǎo)基因型[18]；廣西、云南等地HCV 6a和3a型較多[19]。本研究結(jié)果顯示HCV基因型分布與感染途徑有關(guān)，經(jīng)輸血途徑、外傷、拔牙等血源途徑感染HCV的基因型以1b型為主，3b型多見于靜脈藥癮、有創(chuàng)美容者；性接觸感染者多分布于6型。另有部分HCV感染者的傳播途徑不明，其基因型以1b型為主，其次為6型和3b型，該部分患者多有不正規(guī)針灸、拔罐、不安全注射史及足浴等行為。由此可見，傳播方式多樣化發(fā)展是導(dǎo)致HCV基因型分布多樣性的重要原因之一。同時(shí)本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有4例靜脈藥癮丙型肝炎患者，經(jīng)規(guī)范DAA治療后再次感染不同基因型HCV。隨著DAA的廣泛使用，HCV感染治愈不再是難題，這也提示HCV不同基因型反復(fù)感染的比例有可能增多，為今后HCV的防控提出了新的挑戰(zhàn)。

雖然HCV基因型在全球及全國的地域分布存在差異，但本研究顯示貴州省內(nèi)各地區(qū)分布并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從性別、年齡分布來看，國內(nèi)外報(bào)道HCV基因型與性別、年齡的相關(guān)性各有不同，對(duì)我國西南地區(qū)HCV感染者基因型的研究[20]提示HCV基因型分布與性別相關(guān)；彭雪彬等[21]報(bào)道HCV基因型分布與年齡無相關(guān)性，而李威等[22]研究顯示我國HCV 6a型丙型肝炎患者較為年輕。本研究結(jié)果顯示貴州地區(qū)不同HCV基因型感染者的性別、年齡分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；男性感染者中3b型所占比例明顯高于其他基因型，而女性感染者1b型所占比例最高，這與以往報(bào)道[14]不同?？赡芘c男女感染途徑不同有關(guān)，本研究數(shù)據(jù)顯示女性有創(chuàng)美容和輸血感染比例(18.47%、12.16%)高于男性(2.61%、4.69%)，而男性靜脈藥癮感染比例高于女性(70.40% vs 36.49%)。提示近年來女性感染HCV的途徑更多樣。本研究年齡分布顯示，低年齡組(≤18歲)和高年齡組(≥60歲)以1b型為主，而19～39歲組以3b、6型為主，40～59歲組1b、3b及6型為主要流行株。年齡分布的差異可能與不同年齡主要的感染方式不同有關(guān)，低年齡組患者多為母嬰垂直傳播，高年齡組的感染方式以輸血感染多見；而中間的兩組年齡段因感染方式多樣，基因型分布呈多樣性。

在發(fā)達(dá)國家，HCV感染率有所下降，但未來20年，因丙型肝炎導(dǎo)致的肝病死亡人數(shù)仍將繼續(xù)增加[6]?；蛐统龑?duì)流行病學(xué)和HCV進(jìn)化表征至關(guān)重要，對(duì)確定治療方案亦同樣重要。HCV基因型是影響療效的重要因素之一[23]，若使用非泛基因型DAA方案，準(zhǔn)確的基因型檢測(cè)，采用個(gè)體化的DAA治療方案，可提高治療應(yīng)答率，減少復(fù)發(fā)，同時(shí)減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。根據(jù)丙型肝炎流行病學(xué)特點(diǎn)，應(yīng)加強(qiáng)HCV主要傳播方式的健康宣教，提高對(duì)美容、口腔、中醫(yī)治療的消毒管理，減少因性接觸、有創(chuàng)美容、牙科治療及中醫(yī)針灸等治療造成的HCV感染；同時(shí)還應(yīng)增強(qiáng)對(duì)靜脈藥癮者的篩查與管理，并降低不同基因型重復(fù)感染的發(fā)生。因此，分析HCV基因型分布特點(diǎn)對(duì)臨床治療和不同傳播途徑的防控具有重要意義。