澤瀉水提物的化學(xué)成分研究

朱懷昌，陶美娟，楊玉琳，李小艷*，許文,2*，黃鳴清,2，吳水生,2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物東方澤瀉[Alismaorientale(Sam.)Juzep.]的干燥塊莖，是福建省道地藥材，具有利水滲濕、泄熱化濁、降血脂等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明澤瀉具有廣泛的生物活性，如利尿[2]、抗草酸鈣結(jié)晶[3]、降脂[4]、抗炎[5]、抗氧化等[6]。從19世紀(jì)60年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對澤瀉的化學(xué)成分研究主要集中在澤瀉脂溶性部位，化學(xué)成分主要以三萜類為主，分離并鑒定已達(dá)近百種[7]，但是對其水溶性化學(xué)成分的研究尚不足，僅有多糖、氨基酸、膽堿等成分報(bào)道[8]，澤瀉湯劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道。臨床上，澤瀉除了用散劑外，多為水煎劑，如澤瀉湯、豬苓湯、柴苓湯等。因此，研究澤瀉水提物化學(xué)成分不僅為澤瀉水溶性化學(xué)成分闡明奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為澤瀉湯劑的藥理活性提供科學(xué)依據(jù)，對闡明澤瀉臨床用藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要的科學(xué)意義。

除了具有利水滲濕作用外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)澤瀉水提物還具有降糖[9]和抗氧化作用[6]，另有文獻(xiàn)研究表明澤瀉提物具有激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的作用[10]，Nrf2是機(jī)體最主要的抗氧化信號系統(tǒng)，與血脂、血糖等信號調(diào)控關(guān)系密切[10]，Nrf2靶點(diǎn)激活劑如姜黃素[11]、白藜蘆醇[12]等具有良好的降糖、改善胰島素抵抗作用，因此澤瀉水提物中可能具有激活Nrf2的化學(xué)成分，故本研究對澤瀉水提物進(jìn)行化學(xué)成分分離鑒定，并采用熒光素酶報(bào)告基因法篩選澤瀉水提物中激活Nrf2活性成分，為澤瀉水提物的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和水溶性部位的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

柱色譜硅膠(100～200目，青島海洋化工有限公司)；Bruker Avance超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；Waters Auto Purification 自動純化系統(tǒng)；Waters SQD2 型質(zhì)譜(美國Waters公司)；LC-20A 型半制備液相色譜儀(日本島津公司)；軸向壓縮層析柱中低壓液相色譜儀(蘇州利穗科技有限公司)；色譜填料Sephadex LH-20和Toyopearl HW-40S(北京綠百草科技發(fā)展有限公司)。

293T細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室保存)；Nrf2表達(dá)質(zhì)粒pGL3-ARE、空載質(zhì)粒pGL3-N(廈門欣基生物科技有限公司)；Lipofectamine3000脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System(英國Promega公司)；Nrf2陽性藥叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone,tBHQ)購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)；其余試劑均為分析純。

澤瀉干燥塊莖采自福建建甌市吉陽GAP種植基地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室正高級實(shí)驗(yàn)師范世明鑒定為澤瀉科澤瀉屬植物東方澤瀉[Alismaorientale(Sam.)Juzep.]的干燥塊莖，樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物標(biāo)本室。

2 提取與分離

澤瀉干燥塊莖10 kg，粉碎，過60目篩。用超純水(3×60 L)加熱回流提取3次，減壓濃縮得到澤瀉水提物(濃度1 g生藥/mL)，用乙酸乙酯30 L萃取6次，合并濃縮得到上層乙酸乙酯部位(78 g)，硅膠拌樣，用130 mm×650 mm型軸向壓縮層析柱(填料：100～200目硅膠)，流動相：石油醚-乙酸乙酯，進(jìn)行梯度洗脫(20∶1→1∶4)，每250 mL接一個餾分，經(jīng)TLC薄層合并，得到5個亞組分Fr.1～5。Fr.1經(jīng)Sephadex LH-20(CHCl3-MeOH 1∶1)純化得到化合物9(13 mg)、化合物10(17 mg)，F(xiàn)r.3經(jīng)自動純化液相制備系統(tǒng)(乙腈-水55∶45)得到化合物11(23 mg)、化合物12(12 mg)，F(xiàn)r.4經(jīng)自動純化液相制備系統(tǒng)(乙腈-水48∶52)得到化合物14，經(jīng)進(jìn)一步的硅膠(石油醚-乙酸乙酯1∶2)洗脫純化得到化合物14(18 mg)；Fr.5經(jīng)自動純化液相制備系統(tǒng)(乙腈-水48∶52)和LC-20A型半制備液相色譜儀(乙腈-水45∶55)制備得到化合物13(25 mg)和15(12 mg)。

下層水溶性部分用3倍量80%乙醇醇沉，放入4 ℃冷藏柜冷藏24 h，醇沉多糖后取出抽濾，棄去多糖，收集過濾液，濾液減壓濃縮，硅膠拌樣上樣硅膠柱，以CHCl3-MeOH進(jìn)行梯度洗脫(20∶1→1∶4)，得到6個亞組分(Fr.1～Fr.6)，F(xiàn)r.1～Fr.5用Sephadex LH-20(MeOH)和Toyopearl HW-40S(甲醇-水 1∶3)進(jìn)行反復(fù)的凝膠柱層析，最后得化合物1(11 mg)、化合物2(13 mg)、化合物3(33 mg)、化合物4(200 mg)、化合物5(12 mg)。Fr.6在硅膠上先用EtOAc-MeOH-H2O-HAc(12∶3∶1∶1)洗脫液進(jìn)行柱層析，并用Toyopearl HW-40S在流動相甲醇-水(1∶3)中進(jìn)行凝膠柱層析，進(jìn)一步純化得到化合物6(34 mg)、化合物7(20 mg)、化合物8(25 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色粉末，ESI-MSm/z:181 ([M+H]+,C6H12O6:M=180)。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:3.66,3.54 (2H,d,J=11.5 Hz,H-1),4.11 (1H,d,J=8.5 Hz,H-3),3.94 (1H,dd,J=8.5,7.5 Hz,H-4),3.74 (1H,m,H-5),3.72,3.60 (2H,dd,J=11.0,3.0 Hz,H-6);13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:61.5 (C-1),105.2 (C-2),78.7 (C-3),77.2 (C-4),83.5 (C-5),64.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的β-D-呋喃果糖基本一致[13-14]，故鑒定化合物1為β-D-呋喃果糖(β-D-fructofuranose)。

化合物2：無色油狀物，ESI-MSm/z:209 ([M+H]+,C8H16O6:M=208)。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:3.71 (2H,m,H-1),4.09 (1H,d,J=8.0 Hz,H-3),3.94 (1H,t,J=7.5 Hz,H-4),3.64 (2H,d,J=11.5 Hz,H-6),3.74 (2H,m,H-1′),1.14 (3H,t,J=7.0 Hz,H-2′);13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:61.2 (C-1),104.8 (C-2),77.6 (C-3),76.1 (C-4),82.1 (C-5),63.8 (C-6),58.3 (C-1′),15.7 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的β-D-乙基呋喃果糖苷基本一致[15-16]，故鑒定化合物2為β-D-乙基呋喃果糖苷(ethyl β-D-fructofuranoside)。

化合物3：棕紅油狀物，ESI-MSm/z:127 ([M+H]+,C6H6O3:M=126)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:9.41 (1H,s,H-1),7.49 (1H,d,J=3.6 Hz,H-3),6.64 (1H,d,J=3.6 Hz,H-4),4.66 (2H,s,H-6);13C-NMR (100 MHz,D2O)δ:180.3 (C-1),161.3 (C-2),126.8 (C-3),110.9 (C-4),151.6 (C-5),56.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的5-羥甲基糠醛基本一致[17]，故鑒定化合物3為5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furaldehyde)。

化合物4：無色粉末，ESI-MSm/z:343 ([M+H]+,C12H22O11:M=342)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:5.42 (1H,d,J=3.8 Hz,H-1′),4.22 (1H,d,J=8.7 Hz),4.05 (1H,t,J=8.4 Hz),3.74-3.92 (9H,m),3.56 (1H,dd,J=10.0,3.8 Hz),3.47 (1H,t,J=9.3 Hz);13C-NMR (100 MHz,D2O)δ:62.2 (C-1),103.6 (C-2),81.3 (C-3),76.3 (C-4),73.8 (C-5),60.0 (C-6),92.5 (C-1′),72.3 (C-2′),72.5 (C-3′),71.0 (C-4′),69.1 (C-5′),61.2 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的蔗糖基本一致[18]，故鑒定化合物4為蔗糖(sucrose)。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z:505 ([M+H]+,C18H32O16:M=504)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:5.01 (1H,d,J=3.8 Hz,環(huán)A H-1),5.44 (1H,d,J=3.8 Hz,環(huán)B H-1),4.24 (1H,d,J=8.8 Hz,環(huán)C H-3),3.68-4.09 (13H,m),3.53-3.60 (2H,m),13C-NMR (100 MHz,D2O)δ:環(huán)A:98.3 (C-1),68.4 (C-2),69.3 (C-3),69.1 (C-4),71.3 (C-5),61.0 (C-6);環(huán)B:91.20 (C-1),70.0 (C-2),73.8 (C-3),69.3 (C-4),72.5 (C-5),65.8 (C-6);環(huán)C:61.3 (C-1),103.7 (C-2),76.2 (C-3),70.8 (C-4),81.2 (C-5),62.4 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的棉子糖基本一致[19]，故鑒定化合物5為棉子糖(raffinose)。

化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z:667 ([M+H]+,C24H42O21:M=666)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:4.99 (1H,J=3.8 Hz,環(huán)A H-1),4.99 (1H,J=4.0 Hz,環(huán)B H-1),5.42 (1H,J=3.9 Hz,環(huán)C H-1),4.22 (1H,J=8.7 Hz,環(huán)D H-3),3.98-4.08 (2H,m),3.50-3.93 (15H,m);13C-NMR (100.0 MHz,D2O)δ:環(huán)A:98.0 (C-1),68.2 (C-2),69.4 (C-3),69.1 (C-4),70.9 (C-5),61.0 (C-6);環(huán)B:98.2 (C-1),68.3 (C-2),69.2 (C-3),69.2 (C-4),68.7 (C-5),66.3 (C-6);環(huán)C:92.1 (C-1),70.9 (C-2),72.8 (C-3),69.4 (C-4),71.2 (C-5),65.7 (C-6);環(huán)D:61.4 (C-1),103.7 (C-2),76.5 (C-3),74.0 (C-4),81.4 (C-5),62.4 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的水蘇糖基本一致[20]，故鑒定化合物6為水蘇糖(stachyose)。

化合物7：白色粉狀物，ESI-MSm/z:851 ([M+Na]+,C30H52O26:M=828)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:5.43 (1H,d,J=2.4 Hz,α-D-葡萄糖 H-1),4.99 (3H,br s);13C-NMR (100 MHz,D2O)δ:環(huán)A:101.2 (C-1),71.5 (C-2),72.3 (C-3),71.1 (C-4),72.2 (C-5),64.0 (C-6);環(huán)B:100.8 (C-1),72.2 (C-2),71.1 (C-3),69.3 (C-4),71.7 (C-5),69.1 (C-6);環(huán)C:100.6 (C-1),71.1 (C-2),72.0 (C-3),69.2 (C-4),71.1 (C-5),68.6 (C-6);環(huán)D:94.9 (C-1),74.1 (C-2),75.5 (C-3),71.2 (C-4),73.8 (C-5),65.3 (C-6);環(huán)E:63.3 (C-1),106.6 (C-2),79.2 (C-3),84.2 (C-4),76.8 (C-5),64.3 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的毛蕊花糖基本一致[21]，故鑒定化合物7為毛蕊花糖(verbascose)。

化合物8：白色結(jié)晶粉末，ESI-MSm/z:505 ([M+H]+,C18H32O16:M=504)。1H-NMR (400 MHz,D2O)δ:5.27 (1H,d,J=3.8,環(huán)C H-1),4.99 (3H,br s);13C-NMR (100 MHz,D2O)δ:環(huán)A:98.9 (C-1),69.0 (C-2),70.2 (C-3),70.0 (C-4),71.7 (C-5),61.9 (C-6);環(huán)B:98.8 (C-1),69.2 (C-2),70.2 (C-3),70.1 (C-4),69.6 (C-5),67.3 (C-6);環(huán)C:93.0 (C-1),72.2 (C-2),73.8 (C-3),70.5 (C-4),70.7 (C-5),66.6 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的甘露三糖基本一致[22-23]，故鑒定化合物8為甘露三糖(manninotriose)。

化合物9：白色粉末，ESI-MSm/z:261 ( [M+Na]+,C15H26O2:M=238)。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.96,0.97 (3H each,d,J=3.64 Hz,H-12,H-13),1.21,1.27 (3H each,s,H-14,H-15),5.51 (1H,d,H-6);13C-NMR (67.5 MHz,CDCl3)δ:50.6 (C-1),21.5 (C-2),40.5 (C-3),80.1 (C-4),50.2 (C-5),121.3 (C-6),149.6 (C-7),25.0 (C-8 ),42.6 (C-9),75.2 (C-10),37.2 (C-11),21.3 (C-12 ),21.4 (C-13),22.5 (C-14 ),21.1 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)氧澤瀉烯基本一致[24-25]，故鑒定化合物9為環(huán)氧澤瀉烯(alismoxide)。

化合物10：無色油狀物，ESI-MSm/z:243 ([M+Na]+,C15H24O:M=220)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.97 (6H,t,J=4.0 Hz,H-12,13),1.22 (3H,s,H-14),4.74,4.68 (each 1H,brs,H-15),5.54 (1H,s,H-6);13C-NMR (67.5 MHz,CH3OH)δ:55.8 (C-1),25.7 (C-2),40.7 (C-3),81.0 (C-4),48.9 (C-5),123.2 (C-6),150.3 (C-7),31.0 (C-8),38.2 (C-9),155.2 (C-10),38.7 (C-11),21.7 (C-12),22.0 (C-13),24.1 (C-14),107.0 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的澤瀉烯醇基本一致[26]，故鑒定化合物10為澤瀉烯醇(alismol)。

化合物11：白色粉末，ESI-MSm/z:509 ([M+Na]+,C30H46O5:M=486)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.91,1.07,1.08,1.11,1.13,1.16,1.29 (各3H,s,30,29,28,19,26,27,18-CH3),1.23 (3H,d,J=9.0 Hz,H-21),1.89 (1H,d,J=13.5 Hz,H-9),2.69 (1H,d,J=10.0 Hz,H-24),2.92 (1H,m,H-20),3.16 (1H,dd,J=7.0,17.5 Hz,H-12),3.06 (1H,m,H-23),4.04 (1H,m,H-11);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:30.8 (C-1),33.5 (C-2),219.5 (C-3),46.9 (C-4),48.4 (C-5),19.9 (C-6),34.9 (C-7),39.9 (C-8),48.6 (C-9),36.9 (C-10),69.4 (C-11),35.7 (C-12),176.7 (C-13),49.7 (C-14),45.5 (C-15),208.2 (C-16),139.3 (C-17),23.2 (C-18),25.4 (C-19),26.2 (C-20),20.0 (C-21),37.7 (C-22),69.7 (C-23),67.6 (C-24),59.3 (C-25),19.4 (C-26),24.8 (C-27),29.5 (C-28),19.1 (C-29),23.5 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的澤瀉醇C基本一致[25]，故鑒定化合物11為澤瀉醇C(alisol C)。

化合物12：白色粉末，ESI-MSm/z:491 ([M+Na]+,C30H44O4:M=468)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.97,0.97,1.08,1.12,1.12,1.19,1.32 (各3H,s,19,30,29,28,18,26,27-CH3),1.25 (3H,d,J=7.2 Hz,H-21),2.41 (1H,d,J=10.8 Hz,H-9),2.71 (1H,d,J=8.0 Hz,H-24),3.02 (1H,m,H-22),3.14 (1H,m,H-23),6.18 (1H,dd,J=2.0,10.0 Hz,H-12),6.72 (1H,dd,J=3.2,10.0 Hz,H-11);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:32.2 (C-1),33.3 (C-2),219.0 (C-3),47.2 (C-4),46.1 (C-5),19.2 (C-6),31.2 (C-7),39.1 (C-8),48.1 (C-9),36.0 (C-10),138.2 (C-11),122.1 (C-12),171.5 (C-13),47.7 (C-14),44.4 (C-15),208.0 (C-16),138.5 (C-17),24.1 (C-18),24.9 (C-19),25.8 (C-20),19.4 (C-21),38.4 (C-22),69.4 (C-23),67.5 (C-24),59.0 (C-25),19.3 (C-26),24.7 (C-27),29.2 (C-28),19.2 (C-29),21.9 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的澤瀉醇L基本一致[26]，故鑒定化合物12為澤瀉醇L(alisol L)。

化合物13：白色粉末，ESI-MSm/z:527 ([M+Na]+,C30H48O6:M=504)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.89,1.07,1.08,1.11,1.16,1.29,1.32 (3H each,s),1.23 (3H,d,J=7.0 Hz),1.91 (1H,d,J=11.5 Hz,H-9),1.97 (1H,d,J=18.5 Hz,Ha-15),2.48 (1H,d,J=19.0 Hz,Hb-15),3.01 (1H,d,J=5.5 Hz,H-24),3.20 (1H,dd,J=6.0,14.5 Hz,Ha-12),3.61 (1H,d,J=7.5 Hz,H-23),4.05 (1H,dd,J=6.0 Hz,H-11);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:30.8 (C-1),33.5 (C-2),219.5 (C-3),46.9 (C-4),48.3 (C-5),19.9 (C-6),34.9 (C-7),40.0 (C-8),48.4 (C-9),36.9 (C-10),69.3 (C-11),34.9 (C-12),177.3 (C-13),50.1 (C-14),45.2 (C-15),209.6 (C-16),140.3 (C-17),23.1 (C-18),25.4 (C-19),25.6 (C-20),20.0 (C-21),36.2 (C-22),69.6 (C-23),77.0 (C-24),73.8 (C-25),27.0 (C-26),26.3 (C-27),29.5 (C-28),19.3 (C-29),23.4 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的16-羰基澤瀉醇A基本一致[25]，故鑒定化合物化合物13為16-羰基澤瀉醇A(16-oxo-alisol A)。

化合物14：白色粉末，ESI-MSm/z:569 ([M+Na]+,C32H50O7:M=546)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.89,1.07,1.08,1.12,1.13,1.24,1.33 (各3H,s,18,19,29,30,28,26,27-CH3),1.16 (3H,d,J=6.4 Hz,H-21),1.94 (1H,d,J=9.6 Hz,H-9),2.20 (3H,s,OAc),3.20 (1H,dd,J=6.0,14.0 Hz,H-12),3.79 (1H,dd,J=2.4,9.2 Hz,H-23),4.05 (1H,m,H-11),4.60 (1H,brd,J=1.2 Hz,H-24);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:31.9 (C-1),33.5 (C-2),219.5 (C-3),46.9 (C-4),48.4 (C-5),20.8 (C-6),34.9 (C-7),40.1 (C-8),48.7 (C-9),36.9 (C-10),69.8 (C-11),39.4 (C-12),177.4 (C-13),50.1 (C-14),45.6 (C-15),209.4 (C-16),140.0 (C-17),22.9 (C-18),25.3 (C-19),25.6 (C-20),20.0 (C-21),36.1 (C-22),72.6 (C-23),78.4 (C-24),69.5 (C-25),27.1 (C-26),26.8 (C-27),29.5 (C-28),19.2 (C-29),23.4 (C-30),170.9 (C-31),21.3 (C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A基本一致[25]，故鑒定化合物14為16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A(16-oxo-alisol A 24-acetate)。

化合物15：ESI-MSm/z:489 ([M+H]+,C30H48O5:M=488)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:1.23 (3H,d,J=6.56 Hz,H-21),3.63 (1H,d,J=10.5 Hz,H-23),3.02 (1H,brs,H-24);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:31.74 (C-1),34.53 (C-2),219.31 (C-3),46.98 (C-4),48.05 (C-5),19.97 (C-6),33.58 (C-7),40.51 (C-8),42.71 (C-9),36.22 (C-10),22.17 (C-11),24.99 (C-12),180.40 (C-13),50.44 (C-14),45.43 (C-15),209.96 (C-16),140.23 (C-17),23.35 (C-18),23.67 (C-19),26.98 (C-20),19.51 (C-21),40.29 (C-22),69.37 (C-23),77.36 (C-24),73.69 (C-25),25.47 (C-26),26.34 (C-27),29.25 (C-28),19.69 (C-29),22.02 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的16-羰基-11-去氧澤瀉醇A基本一致[27]，故鑒定化合物15為16-羰基-11-去氧澤瀉醇A(16-oxo-11-deoxy-alisol A)。

4 澤瀉單體對Nrf2活性篩選

參考文獻(xiàn)報(bào)道的Nrf2活性篩選方法[28]，將澤瀉單體用培養(yǎng)基(糖類)或DMSO溶解后(三萜和倍半萜，DMSO體積比<0.5%)，用培養(yǎng)基稀釋為樣品系列工作液，終濃度均為1、10、50 μmol·L-1。培養(yǎng)293T細(xì)胞至對數(shù)生長期后，取出鋪24板細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入500 μL不含抗生素的完全培養(yǎng)基，24 h之后，每孔板加入600 ng的pGL3-ARE質(zhì)粒(空白對照組用空載質(zhì)粒對照)，采用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，各孔細(xì)胞按分組給予系列樣品和陽性對照藥(tBHQ)處理，24 h后，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后直接加入報(bào)告基因細(xì)胞裂解液，取50 μL培養(yǎng)基上清測定。用螢火蟲熒光素酶測定得到的相對發(fā)光單位(relative light unit,RLU)值與Renilla熒光素酶測定得到的RLU值的比值來比較樣品對Nrf2/ARE目的報(bào)告基因的激活程度。澤瀉水提物中分離得到15個化合物對Nrf2活性檢測的結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，不同濃度的化合物1～10對Nrf2/ARE目的報(bào)告基因均沒有激活作用；而化合物11～15可顯著激活Nrf2/ARE目的報(bào)告基因，并且在濃度為10 μmol·L-1時(shí)，5個化合物激活程度均達(dá)到峰值。當(dāng)濃度為1和10 μmol·L-1時(shí)，5個化合物組和陽性對照藥tBHQ組相比無顯著性差異，并且呈劑量依賴，而當(dāng)濃度高達(dá)50 μmol·L-1時(shí)激活作用與10 μmol·L-1無顯著性差異，結(jié)合結(jié)構(gòu)分析，本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有Nrf2激活作用的物質(zhì)均為澤瀉16-羰基的三萜類成分，而同時(shí)測試的《中國藥典》指標(biāo)性成分三萜23-乙酰澤瀉醇B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16位非羰基取代的23-乙酰澤瀉醇B未表現(xiàn)明顯激活作用，因此16-羰基取代的澤瀉三萜可能是澤瀉激活Nrf2信號通路的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

5 討論

本次研究從澤瀉水提物中共分離鑒定得到15種化合物，包括8個糖類、2個倍半萜和5個三萜，其中糖類8個，分別為β-D-呋喃果糖、β-D-乙基呋喃果糖苷、5-羥甲基糠醛、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖和甘露三糖；倍半萜2個，分別為環(huán)氧澤瀉烯和澤瀉烯醇；三萜類5個，分別為澤瀉醇C、澤瀉醇L、16-羰基澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A和16-羰基-11-去氧澤瀉醇A。

圖1 澤瀉中15個化合物對Nrf2驅(qū)動的報(bào)告基因活性作用(均值±SD，n=3)注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

課題組前期研究表明澤瀉水提物小分子化合物也具有降糖作用[9]，相比與澤瀉脂溶性部位分離的成分[9]，首先澤瀉水提物中具有較多的糖類，包括單糖和低聚糖(棉子糖，水蘇糖，毛蕊花糖和甘露三糖)，并且目前文獻(xiàn)報(bào)道低聚糖棉子糖和水蘇糖等具有良好的改善腸道微生態(tài)的作用[29-30]，低聚糖可以通過調(diào)控腸道微生態(tài)發(fā)揮降脂、降糖的作用；其次，除了糖類，在水提物中也分離鑒定到2個倍半萜類化合物，環(huán)氧澤瀉烯可以促進(jìn)脂肪分化，對2型糖尿病小鼠有降糖作用[31]，澤瀉烯醇具有抗炎作用[8]，提示澤瀉倍半萜可能是其降糖的物質(zhì)基礎(chǔ)之一；第三，在水提物中分離得到5個微量三萜類成分，與脂溶性部位分離得到的三萜相比，這些三萜類極性相對較大，均具有16位羰基取代，而脂溶性部位分離的三萜以23-乙酰澤瀉醇B(《中國藥典》指標(biāo)性成分，無16位羰基取代)等為主，本次的水提物中暫未富集得到23-乙酰澤瀉醇B，兩者的三萜組成存有差異。水提物中分離得到的澤瀉醇C、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇L等三萜化合物可促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取[32]和抗炎、激活PPAR等活性[33]，并且本次實(shí)驗(yàn)采用熒光素酶報(bào)告基因法檢測澤瀉水提物15個化合物中對Nrf2報(bào)告基因表達(dá)活性的影響，篩選出對Nrf2具有激活作用的物質(zhì)均為澤瀉16-羰基的三萜類成分，因此16-羰基取代的澤瀉三萜可能也是澤瀉降糖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

綜上所述，通過化學(xué)分離，澤瀉水提物中具有較多的單糖、低聚糖類物質(zhì)，并且同時(shí)也含有微量的倍半萜和三萜類成分，均可能是澤瀉湯劑揮發(fā)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中澤瀉醇C、澤瀉醇L、16-羰基澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A和16-羰基-11-去氧澤瀉醇A可激活Nrf2報(bào)告基因，可能是澤瀉激活Nrf2信號系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本研究為臨床澤瀉湯劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用探索提供基礎(chǔ)，豐富澤瀉水提物化學(xué)成分研究，為澤瀉水溶性部位的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。