大鼠體外心肺復(fù)蘇模型的建立與評(píng)價(jià)

于 潔，薛平菲，陳書弘，秦春妮，張藍(lán)予，王壽世，黑飛龍

體外心肺復(fù)蘇（extracorporeal cardiopulmonary resuscitation，ECPR）支持是指在體外膜氧合（extra?corporeal membrane oxygenation，ECMO）技術(shù)支持下的心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR），即在心臟驟?；颊邚?fù)蘇期間開始體外心肺轉(zhuǎn)流（car?diopulmonary bypass， CPB）［1］。 2019 年，美國心臟協(xié)會(huì)（American Heart Association，AHA）更新了成人CPB與心血管急救指南，提出在有技術(shù)熟練的醫(yī)護(hù)人員迅速支持的情況下，可以考慮對(duì)某些接受常規(guī)CPR失敗的患者應(yīng)用ECPR［2］。盡管許多研究報(bào)道了ECPR的良好效果，但受限于研究質(zhì)量，目前尚沒有充足證據(jù)建議對(duì)心臟驟停患者常規(guī)應(yīng)用ECPR。但不可否認(rèn)的是，ECPR作為挽救難治性心臟驟?；颊叩臐撛谥委熓侄?，正在獲得越來越廣泛的關(guān)注［3-6］。因此，建立穩(wěn)定可重復(fù)且易于操作的ECPR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)于ECPR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展及其在臨床的應(yīng)用，具有重要的意義。

目前，國內(nèi)外關(guān)于ECPR動(dòng)物模型的研究較少，且主要以豬、羊、犬等大動(dòng)物為主，其成本高、人力資源消耗大，不適于廣泛開展［7-8］。而大鼠以其獲取方便、成本低廉、解剖結(jié)構(gòu)及功能與人類相近等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于心血管領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。本研究參考借鑒了國內(nèi)外同行關(guān)于大鼠 ECPR、ECMO及CPR模型的建造方法，并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行了改良，建立了無血預(yù)充SD大鼠ECPR模型，為進(jìn)一步研究ECPR技術(shù)創(chuàng)造了穩(wěn)定且經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠8只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，體重450～500 g，術(shù)前禁食 8 h，禁飲 2 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 小動(dòng)物ECMO系統(tǒng)，包含：雙頭滾壓泵（德國Stockert公司）、小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用膜肺及配套管路（東莞科威醫(yī)療器械有限公司）；14 G、20 G、22 G、24 G套管針（美國Becton Dickinson公司）；自制多孔靜脈引流管；小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD?Instruments公司）；自制手持式小動(dòng)物電動(dòng)心肺復(fù)蘇機(jī)；溫度計(jì)；加熱墊；電凝設(shè)備；外科手術(shù)器械。

1.3 麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備 SD大鼠稱重后3%～4%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉，仰臥位固定四肢于操作臺(tái)，頸部正中皮下局部浸潤麻醉，迅速游離并切開氣管，置入14 G套管針，接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，吸入空氣，潮氣量 8～10 ml／kg，呼吸頻率 60 次／min，1.5%～2.5%異氟烷吸入維持麻醉，電子溫度計(jì)石蠟油潤滑后置入肛門，加熱墊通電，用于術(shù)中維持體溫。

1.4 手術(shù)操作 SD大鼠手術(shù)部位備皮、消毒，1%利多卡因局部浸潤麻醉，仔細(xì)游離尾動(dòng)脈、右股動(dòng)脈及右頸外靜脈并于外科顯微鏡下穿刺置管：其中右股動(dòng)脈置入24 G套管針，置管成功后注射300 IU／ml肝素0.5 ml，連接Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀監(jiān)測心率及血壓；尾動(dòng)脈根據(jù)血管直徑置入20 G或22 G套管針，用于ECMO動(dòng)脈端灌注；右頸外靜脈置入自制多孔靜脈引流管，用于ECMO支持過程中的靜脈引流。

1.5 ECMO系統(tǒng)安裝及預(yù)充 ECMO系統(tǒng)由儲(chǔ)血室（20 ml注射器）、滾壓泵、小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用膜肺及配套管路組成。ECMO管路采用無血預(yù)充，預(yù)充液包含6%羥乙基淀粉（萬汶）13 ml及300 IU／ml肝素 0.5 ml。

1.6 ECPR的建立 連接ECMO管路靜脈端及動(dòng)脈端并用血管鉗夾閉，關(guān)閉小動(dòng)物呼吸機(jī)，夾閉SD大鼠氣管插管并計(jì)時(shí)，血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）低于 25 mm Hg視為SD大鼠發(fā)生心臟驟停（cardiac arrest，CA），繼續(xù)窒息4 min。開放氣道，純氧機(jī)械通氣。使用自制的小動(dòng)物心肺復(fù)蘇機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行胸外按壓（按壓頻率200 bpm，深度為胸廓前后徑的1／3），經(jīng)尾動(dòng)脈插管給予腎上腺素，開放ECMO管路動(dòng)脈端及靜脈端，開始轉(zhuǎn)機(jī)，初始流量 60～80 ml／（kg·min），氧氣流量1～1.5 L／min，根據(jù)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測結(jié)果調(diào)整轉(zhuǎn)機(jī)參數(shù)，并根據(jù)實(shí)際需求追加腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等血管活性藥物，維持MAP＞60 mm Hg。若連續(xù)按壓10 min仍無自主循環(huán)恢復(fù)（return of spontaneous circulation，ROSC），視為復(fù)蘇失敗。 復(fù)蘇后1 h，停機(jī)、拔管，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并取材。

1.7 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)處理 持續(xù)監(jiān)測SD大鼠呼吸、血壓及肛溫，分別于CA前及復(fù)蘇后30 min抽取動(dòng)脈血測血?dú)?。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，復(fù)蘇前后數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠ECPR模型建立情況 實(shí)驗(yàn)用8只SD大鼠體重為（474.5±18.95）g，除 1 只因右頸外靜脈置管時(shí)穿破血管壁大量失血死亡，剩余7只均成功通過窒息法致 CA，并于 ECPR實(shí)施后實(shí)現(xiàn) ROSC，ECPR模型成功率87.5%。夾閉氣管后，SD大鼠立刻開始劇烈掙扎，血壓上升，心率加快，隨著窒息時(shí)間延長，大鼠掙扎逐漸減弱，心率降低并出現(xiàn)心律失常，最終心臟搏動(dòng)消失、脈壓消失，MAP低于25 mm Hg，視為發(fā)生 CA，窒息時(shí)間（230.8±29.9）s。 CA 開始4 min后，進(jìn)行ECPR，在胸外按壓及ECMO輔助下，大鼠血壓迅速上升，ROSC 時(shí)間（321.7±120.6）s，實(shí)驗(yàn)過程中SD大鼠靜脈-動(dòng)脈（venous-artery，VA）ECMO循環(huán)管路參見圖1，血壓變化參見圖2。

圖1 大鼠V-A ECMO管路圖

圖2 ECPR期間血壓變化圖

2.2 血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)夥治?表1為SD大鼠復(fù)蘇前后體溫、血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)鈹?shù)據(jù)的比較，結(jié)果顯示：ECPR前后MAP及心率未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，體溫、血?dú)鈹?shù)據(jù)變化較為明顯，尤其是 pH、BE、HCO3

-（P＜0.05）這可能與 CA 期間機(jī)體嚴(yán)重缺血缺氧導(dǎo)致酸中毒有關(guān)；血細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）較 ECPR 前下降顯著（P＜0.001），這可能與無血預(yù)充ECMO循環(huán)管路造成大鼠血液稀釋有關(guān)；盡管PO2與SO2復(fù)蘇前后統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異顯著（P＜0.01），但主要與復(fù)蘇期間供氧有關(guān)，且SO2統(tǒng)計(jì)值顯示，復(fù)蘇前后大鼠血氧飽和度均在95%以上，并無實(shí)際臨床意義；復(fù)蘇前后 Na＋、K＋、Ca2＋離子濃度未見顯著差異（P＞0.05）。

表1 大鼠基本資料、血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)夥治觯╪＝7，±s）

表1 大鼠基本資料、血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)夥治觯╪＝7，±s）

項(xiàng)目 窒息前 ECPR后30 min P值心率（次／） 345±20.15 332.7±20.02 0.058 MAP（mm Hg） 100.29±9.53 95.86±9.65 0.074體溫（℃） 37.17±0.39 36.30±0.39 0.002 pH 7.46±0.04 7.24±0.11 0.001 PO2（mm Hg） 76.86±3.98 366±149.02 0.002 PCO2（mm Hg） 33.07±6.82 22.9±9.77 0.072 BE（mmol／L） -1±2.6 -9±3.1 0.006 HCO3-（mmol／L） 23.06±2.94 14.86±2.84 0.002 SO2（%） 96.71±1.38 100.00±0.00 0.001 Na＋（mmol／L） 139.43±2.57 138.00±1.73 0.351 K＋（mmol／L） 4.17±0.41 3.7±0.76 0.156 iCa2＋（mmol／L） 1.23±0.84 1.22±0.76 0.645 HCT 0.47±0.56 0.27±0.03 ＜0.001 Hb（g／L） 159.9±19.1 90.1±9.1 ＜0.001

3 討 論

研究顯示，ECPR可以提高難治性心臟驟?；颊叩纳媛?，并改善其神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后，但目前僅有少數(shù)醫(yī)療中心具備緊急施行ECPR的能力，且其實(shí)施決定常以個(gè)案為基礎(chǔ)，導(dǎo)致目前ECPR相關(guān)臨床研究均被認(rèn)為存在嚴(yán)重的偏倚風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展及應(yīng)用［9-13］。而僅在中國大陸，每年就有超過50萬人發(fā)生心臟驟停，其生存率不足百分之一［14］。因此，建立簡單可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探索ECPR的適應(yīng)證、啟動(dòng)時(shí)機(jī)、臟器保護(hù)等關(guān)鍵問題，對(duì)于該技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義。本研究通過參考借鑒國內(nèi)外同行關(guān)于大鼠ECPR、ECMO及CPR模型的建造方法［15-19］，并結(jié)合本課題組既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行改良，建立了無血預(yù)充SD大鼠ECPR模型。

目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟驟停模型多采用電流致顫法，用于模擬室顫導(dǎo)致的心臟驟停，但由于大鼠基礎(chǔ)心率較快，電流致顫后即使不進(jìn)行胸外按壓，心臟也會(huì)出現(xiàn)自動(dòng)復(fù)律，不利于評(píng)價(jià)搶救效果。窒息法效果確切，主要表現(xiàn)為缺氧導(dǎo)致的心臟停搏，其搶救難度更大。臨床上施行ECPR主要針對(duì)常規(guī)治療手段，如電除顫、胸外按壓等無效或反應(yīng)不佳的患者，這些患者往往存在更嚴(yán)重的組織缺氧及臟器損害，因此，筆者選擇窒息法致心臟驟停的建模方式。值得注意的是，氣管夾閉后，盡管SD大鼠處于麻醉狀態(tài)，但這種極端的刺激會(huì)導(dǎo)致其劇烈掙扎，而采用的14 G套管針改造的氣管插管因缺乏套囊，可因大鼠用力吸氣發(fā)生漏氣，影響窒息效果，因此，本研究采用切開法氣管插管，確保結(jié)扎確切。

高質(zhì)量的胸外按壓是CPR成功的關(guān)鍵，需要兼顧其位置、深度及頻率，還要盡可能避免因按壓過度導(dǎo)致的副損傷。大鼠體積小，心跳頻率快，單純徒手按壓難以保證按壓效果，更無法保證操作均一，因此，筆者采用自制的小動(dòng)物電動(dòng)心肺復(fù)蘇機(jī)，其按壓頻率、深度及力度均可控。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該心肺復(fù)蘇機(jī)性能良好，按壓實(shí)施后大鼠收縮壓迅速上升到70 mm Hg以上，可在大鼠未ROSC前模擬臨床胸外按壓效果，部分代替大鼠心臟的射血功能，配合ECMO血流動(dòng)力學(xué)支持及氧合支持，實(shí)現(xiàn)ECPR。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ECPR前后SD大鼠HCT、Hb下降顯著（P＜0.001），主要考慮與ECMO系統(tǒng)預(yù)充液造成的血液稀釋有關(guān)，但受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異及ECMO轉(zhuǎn)流過程中系統(tǒng)調(diào)節(jié)的影響，不同個(gè)體間血液稀釋程度并不完全一致，而SD大鼠急性貧血其安全界值目前尚無統(tǒng)一定論，雖然血?dú)鉁y量結(jié)果顯示 ECPR 前后 Na＋、K＋、Ca2＋電解質(zhì)濃度未見明顯差異，但進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，消除潛在可能的影響因素，建立更加穩(wěn)定均一的模型，是后續(xù)工作的重點(diǎn)。

本模型建立過程中預(yù)先對(duì)SD大鼠進(jìn)行了血管插管，在需要復(fù)蘇后啟動(dòng)ECMO，這與臨床實(shí)踐中常見的進(jìn)行常規(guī)CPR的同時(shí)超聲引導(dǎo)下進(jìn)行動(dòng)靜脈穿刺置管建立ECMO支持的實(shí)際情況有所不同，這主要是因?yàn)榇笫篌w積小，操作困難，難以在CPR同時(shí)兼顧血管穿刺置管。本研究通過窒息法致心臟驟停，延長大鼠缺氧時(shí)間，進(jìn)而加劇其臟器損傷的方式來平衡這一缺陷，但如何建立更符合臨床實(shí)際的ECPR模型，值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功建立了窒息法致心臟驟停大鼠的ECPR模型，其存活率高，運(yùn)行穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)，可用于進(jìn)一步研究ECMO技術(shù)用于心臟驟?；颊邠尵鹊牟±砩磉^程及損傷臟器保護(hù)，對(duì)于深入探索ECPR的適應(yīng)證、改善ECPR患者的臨床結(jié)局具有積極的意義。