大豆分離蛋白提取及其植酸脫除的研究

魯 洋，史文靜，王文婷，張 錦，郭祥磊，高 燁

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

大豆分離蛋白（SPI）屬于全價蛋白，其資源極其豐富，營養(yǎng)較為全面，而且具有溶解性、分散性、起泡性等特殊性能[1]。SPI中普遍含有一種抗營養(yǎng)因子——植酸，植酸會和SPI包括一些酶結(jié)合形成植酸蛋白質(zhì)復合物，從而影響蛋白質(zhì)的生理功能[2]。當4.5＜pH值＜9.0時，帶負電荷的蛋白質(zhì)、金屬陽離子與帶負電荷的植酸形成難溶的復合物[3]，影響人體對蛋白質(zhì)與礦物質(zhì)的吸收，并且植酸的存在對SPI的溶解性、分散性、起泡性也有一定影響[4]。所以，在SPI的生產(chǎn)中一般都會設法除去植酸。使植酸含量減少的方法主要有溶劑萃取法、膜分離法和離子交換法。其中，溶劑萃取法作為傳統(tǒng)工藝，雖操作簡單，卻有經(jīng)濟效益差、得到的產(chǎn)品雜質(zhì)較多等不足之處[5]。膜分離法是采用有選擇性的高分子生物膜，通過膜兩端的一定濃度和壓力差來選擇性提取原料組分，但膜分離法中交換液的大分子物質(zhì)容易堵塞超濾膜，清理較為麻煩[6]。離子交換法則是通過離子交換樹脂對植酸的吸附作用來得到低植酸含量的產(chǎn)品，該方法較適合食品工業(yè)生產(chǎn)[7]。

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化，探究通過堿溶酸沉法從低溫脫脂豆粕中提取SPI的最佳工藝，然后利用離子交換法研究D001，D201，D301和D152等4種類型樹脂對SPI中植酸脫除的效果，篩選出最佳樹脂，在此基礎上，對比分析脫除植酸前后SPI的理化性質(zhì)。以上研究能夠為低植酸含量的SPI提取及生產(chǎn)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

1.1.1 主要原料

低溫脫脂豆粕，山東萬德福實業(yè)集團提供。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、丙酮，國藥集團化學試劑有限公司提供；無水乙醇，安徽安特食品股份有限公司提供；植酸鈉，Sigma；D001、D201、D301、D152型樹脂，安徽三星樹脂廠提供。

1.2 主要儀器

HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇國盛實驗儀器廠產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；T系列電子天平，上海越平科學儀器有限公司產(chǎn)品；UV-5100H型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；20 mm×200 mm離子交換柱，安徽千玻教學儀器有限公司產(chǎn)品；HL-2型恒流泵、BSZ-160型自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；pHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 大豆分離蛋白的提取試驗

1.3.1 工藝流程

低溫脫脂豆粕→堿溶→離心→酸沉→離心→洗滌、過濾沉淀→烘干得SPI。

1.3.2 操作要點

（1）原料。將豆粕稍加烘干，除去結(jié)塊后備用。

（2）堿溶。向豆粕中加入適量水，調(diào)pH值至堿性條件，在一定溫度下攪拌50 min，溶解其中蛋白質(zhì)。

（3）離心。在4℃條件下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，棄去沉淀。

（4）酸沉。將上清液pH值調(diào)至酸性條件，搖勻，室溫下靜置30 min。

（5）離心。在4℃條件下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，去除上清液。

（6）洗滌、過濾沉淀。用蒸餾水洗滌沉淀并抽濾，直至濾液pH值為中性。

（7）烘干。將得到的SPI凝乳放入烘箱中烘干，粉碎，粉狀物即為SPI[8]。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5—2016（第一法），凱氏定氮法。

1.3.4 SPI提取率的計算

1.3.5 SPI提取單因素試驗

（1）浸提液料液比對SPI提取率的影響。按料液比 1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14配制浸提液，并將pH值調(diào)至10.0，在45℃水浴中浸取50 min，調(diào)pH值為4.5，以沉淀提取SPI[9]。

（2）pH值對SPI提取率的影響。料液比為1∶10時，調(diào)浸取液的pH值分別為8，9，10，11，12，在45℃水浴中浸提50 min，調(diào)pH值為4.5，以沉淀提取SPI[9]。

（3）溫度對SPI提取率的影響。浸提液料液比為1∶10，pH值為10的條件下，分別在35，40，45，50，55℃水浴中浸提50 min，調(diào)pH值為4.5，以沉淀提取SPI[10-11]。

1.3.6 SPI提取正交試驗

按照以上3個單因素試驗結(jié)果進行正交試驗。

SPI提取正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 SPI提取正交試驗因素與水平設計

1.4 脫除植酸最佳樹脂的選擇

1.4.1 樹脂預處理

試驗選擇4種常見的離子交換樹脂，分別為D001大孔強酸性陽離子交換樹脂、D201大孔強堿性陰離子交換樹脂、D301大孔弱堿性陰離子交換樹脂和D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂。預處理方法參照 GB/T 5476—2013。

1.4.2 樹脂吸附能力的測定

分別稱量3.0 g（濕質(zhì)量）4種不同型號的樹脂于500 mL燒杯中，再各加入5%的SPI溶液400 mL，調(diào)溶液pH值至8.0，于室溫下靜置12 h后測樹脂對植酸的吸附能力[12]。

樹脂對植酸的吸附能力=

式中：C1——SPI溶液中植酸的含量，mg/mL；

C2——離子交換后SPI溶液中植酸的含量，mg/mL；

V1——離子交換后SPI溶液的體積，mL；

G——樹脂的濕質(zhì)量，g

1.4.3 SPI中植酸脫除工藝流程

SPI→溶解→進入離子交換柱→流出液調(diào)pH值至 7.0→干燥[13-14]。

1.4.4 SPI中植酸含量測定

參照GB 5009.153—2016測定SPI中植酸含量。

1.5 大豆分離蛋白的理化性質(zhì)

1.5.1 溶解性

將最佳工藝條件下提取的SPI進行植酸脫除后干燥，收集備用。溶解度的測定方法參照GB 5413.29—2010，測量每100 g SPI樣品在規(guī)定條件下溶解后全部溶解的質(zhì)量。

1.5.2 分散速度

室溫下向50 mL燒杯中加入20 mL純水，再加入0.2 g SPI，攪拌30 s，過60目濾網(wǎng)，量取其中5 mL濾液，于105℃下烘干，然后稱質(zhì)量[15]。

式中：G——5 mL濾液固形物質(zhì)量，g。

1.5.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

（1）起泡性的測定方法。向250 mL燒杯中加入200 mL純水，取5 g SPI溶于水，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心2 min，記錄剛離心后的泡沫體積[15]。

式中：V1——泡沫體積，mL；

200——純水體積，mL。

（2）泡沫穩(wěn)定性的測定方法

式中：V1——上述剛離心后的泡沫體積，mL；

V2——靜置30 min后的泡沫體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白提取單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 堿溶浸取液料液比對SPI提取率的影響

浸提液料液比對SPI提取率的影響見圖1。

圖1 浸提液料液比對SPI提取率的影響

從圖1可以看出，在料液比為1∶6～1∶10時，SPI提取率逐漸上升，在1∶10之后逐漸下降。料液比升高時，酸沉提取過程使蛋白乳清中溶解的球蛋白變多，隨之丟失的蛋白也變多，SPI的提取率就會降低。故選擇堿溶最佳料液比為1∶10。

2.1.2 堿溶pH值對SPI提取率的影響

堿溶pH值對SPI提取率的影響見圖2。

從圖2可以看出，pH值為8～10時SPI的提取率越來越高，pH值為10～12時逐漸減小。這可能是因為當pH值變大時蛋白分子的表面電荷變多，溶解的蛋白質(zhì)增加，提取的SPI也隨之增多，然而pH值過高會使蛋白質(zhì)變性，降低了SPI提取率。因此，選擇最佳pH值為10。

2.1.3 堿溶溫度對SPI提取率的影響

堿溶溫度對SPI提取率的影響見圖3。

圖2 堿溶pH值對SPI提取率的影響

圖3 堿溶溫度對SPI提取率的影響

從圖3可以看出，SPI提取率在35～45℃時逐漸升高，超過45℃逐漸降低。溫度升高使SPI溶解度變大，溫度降低溶解度變小，但溫度過高會使SPI變性，溶液黏度增加，其溶解度隨之降低，從而減小了SPI的提取率。故可得出最佳堿溶溫度為45℃。

2.2 大豆分離蛋白提取正交試驗結(jié)果與分析

SPI提取正交試驗結(jié)果見表2。

表2 SPI提取正交試驗結(jié)果

從表2可以看出，3個因素對SPI提取率的影響程度為A＞B＞C，即料液比對SPI提取率的影響最大，溫度最小。最佳工藝條件為A2B2C3，即料液比1∶10，堿溶pH值9，溫度50℃。在最佳工藝下進行驗證試驗，得到SPI提取率為79.01%。

2.3 最佳脫除植酸樹脂選擇的結(jié)果與分析

不同樹脂對植酸的吸附能力見圖4。

圖4 不同樹脂對植酸的吸附能力

不同類型離子交換樹脂對植酸的脫除能力不同，從圖4可以看出，陰離子交換樹脂D201脫除植酸能力比D001，D301，D152型樹脂要強。這可能是由于SPI溶液中植酸易解離出質(zhì)子，其本身帶有較多的負電荷，與D201強堿性陰離子交換樹脂中的負離子進行交換吸附，使植酸能夠被大量脫除。故選擇D201型樹脂作為最佳樹脂用于SPI中植酸的脫除。

2.4 脫除植酸前后SPI理化性質(zhì)分析

2.4.1 SPI溶解度

脫除植酸前后SPI在不同溫度下的溶解度見圖5。

圖5 脫除植酸前后SPI在不同溫度下的溶解度

從圖5可以看出，在20～50℃時，經(jīng)植酸脫除的SPI溶解度逐漸增大，超過50℃時溶解度變化不明顯，該變化趨勢與未經(jīng)過植酸脫除的SPI基本一致，但脫除植酸后的SPI溶解度有所降低，溶解度下降的原因可能是SPI在離子交換過程中與樹脂發(fā)生了交換反應造成。在食品加工生產(chǎn)中SPI的溶解性十分重要，其與SPI其他功能特性，如分散速度、起泡性等均有關，因此研究SPI在不同溫度下的溶解性有一定實際意義。

2.4.2 SPI分散性

脫除植酸前后SPI的分散性見圖6。

圖6 脫除植酸前后SPI的分散性

從圖6可以看到，經(jīng)脫除植酸處理的SPI分散性為65.9%，稍高于未經(jīng)植酸脫除的SPI分散性，這可能是因為不溶性植酸-蛋白質(zhì)復合物的解離所引起的，經(jīng)植酸脫除后的SPI能更好、更快地分散于水中。

2.4.3 SPI起泡性和泡沫穩(wěn)定性

脫除植酸前后SPI在不同溫度下起泡性和泡沫穩(wěn)定性見圖7。

由圖7（a）可以看出，脫除植酸后SPI的起泡能力隨溫度升高而變大，在20～50℃變化較明顯，這一趨勢與未經(jīng)植酸脫除的SPI一致，且經(jīng)過植酸脫除后起泡能力有所增加。由圖7（b）可以看出，隨著溫度升高，泡沫穩(wěn)定性逐漸下降，且經(jīng)植酸脫除的SPI泡沫穩(wěn)定性與未經(jīng)脫除的相比有所降低，可能是由于分子構象發(fā)生變化引起。溫度的升高使SPI溶解性變大，從而改變了SPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎上，利用正交試驗優(yōu)化得出大豆分離蛋白的最佳提取工藝為堿溶浸提液料液比1∶10，堿溶pH值9，堿溶溫度50℃，此時SPI提取率達79.01%。D201，D001，D301和D152這4種樹脂對植酸的脫除效果不同，結(jié)果表明D201型樹脂對植酸的脫除效果最好。脫除植酸后，SPI的溶解度、分散性、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性都有變化，其中，溶解度降低，分散性稍有增加，起泡能力提高而泡沫穩(wěn)定性有所下降。研究得出了一些對提取低植酸含量的SPI有參考和借鑒價值的參數(shù)和結(jié)論，總體上提高了SPI的營養(yǎng)價值。