液液萃取-GFAAS法測(cè)定生物樣品中的Cu(Ⅰ)

張 源， 吳 鵬， 李 慧， 羅紅軍， 羅文鴻， 林哲絢

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室， 廣東 汕頭 515041

引 言

銅離子是生物體不可缺少的微量元素。 銅離子參與生物體一些重要的生理過程， 如細(xì)胞呼吸、 神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、 抗氧化應(yīng)激和鐵離子的攝取[1]。 人體許多疾病與體內(nèi)銅離子失衡有關(guān)， 如糖尿病、 心血管病[1]、 瘋牛病[2]、 AD病[3]和癌癥[4]等。 神經(jīng)退行性疾病由人體喪失銅藍(lán)蛋白的生物活性造成[5]， 有可能與Cu(Ⅰ)的毒性有關(guān)[6]。 腦血栓病人血清小分子蛋白結(jié)合Cu(Ⅱ)含量發(fā)生變化， 同樣會(huì)降低血清銅藍(lán)蛋白活性[7]。 在生物體內(nèi)， 銅以Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)和酶、 蛋白質(zhì)分子以及一些生物小分子如氨基酸絡(luò)合， 通過兩個(gè)形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換而得以進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)[8]。 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銅濃度過高時(shí), Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)之間的氧化還原反應(yīng)能催化產(chǎn)生毒性的羥自由基， 損傷脂肪、 蛋白質(zhì)、 DNA等生物大分子[9]。 因此， 測(cè)定生物體系中的Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)， 可以定量了解生物體內(nèi)銅離子價(jià)態(tài)的變化， 對(duì)研究銅離子形態(tài)失衡有著重要的生理意義。

適宜pH條件下Cu(Ⅱ)與1,10-菲羅啉反應(yīng)形成的Cu(Ⅱ)配合物在光照條件下還原成Cu(Ⅰ)配合物， 可用分光光度法測(cè)定試樣中的Cu(Ⅰ)。 在堿性條件下， 1,10-菲羅啉與Cu(Ⅰ)形成的配合物在428 nm處有光吸收， 用三乙醇胺和亞硫酸鈉聯(lián)合保護(hù)Cu(Ⅰ)不被氧化， 可在混有Cu(Ⅱ)情況下直接測(cè)定Cu(Ⅰ)[10]。 含有Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)離子的樣品與1.5 mmol·L-12-喹啉甲酸鈉鹽于pH 8.7混和后， 用毛細(xì)管電泳將兩者分離后由紫外檢測(cè)器可分別測(cè)定兩者的濃度[11]。 在這些方法文獻(xiàn)中, 測(cè)定Cu(Ⅰ)時(shí)大多集中在無機(jī)樣品中， 且由于這些方法檢測(cè)限高， 靈敏度低， 樣品基體不復(fù)雜， 通常不適合測(cè)定生物樣品中的痕量Cu(Ⅰ)濃度。 用石墨爐原子吸法(GFAAS)測(cè)定銅檢測(cè)限低， 靈敏度高， 目前只能定量測(cè)定總銅[12]， 無法區(qū)分其中的Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)。

在血清中， 銅藍(lán)蛋白能結(jié)合血清中約90%的銅， 銅藍(lán)蛋白既可以通過銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr1結(jié)合Cu(Ⅰ)， 也可結(jié)合血清中多余的Cu(Ⅱ)以抑制脂質(zhì)過氧化作用發(fā)生[13]。 銅藍(lán)蛋白主要通過其分子中的組氨酸殘基上的氮與半胱酸殘基上的硫與Cu(Ⅰ) 和Cu(Ⅱ)結(jié)合[14]。 在三氯乙酸的變性作用下， 血清中蛋白質(zhì)中的銅可全部釋放出來， 堿性條件下， 用鹽酸羥胺將其中的Cu(Ⅱ)還原為Cu(Ⅰ)， 利用Cu(Ⅰ)和BCA(2,2′-聯(lián)喹啉-2,2′二甲酸)鈉鹽反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物， 可用分光光度法測(cè)定血清或生物樣品的總銅[15]。 上述文獻(xiàn)表明， 血清中存在兩種不同價(jià)態(tài)的銅， 但迄今為止， 沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道血清中Cu(Ⅰ)的定量檢測(cè)方法。

本研究利用堿性條件下甘氨酸螯合銅Cu(Ⅱ)溶于水不溶于有機(jī)溶劑[16]而亞銅試劑(2,2′-聯(lián)喹啉)與Cu(Ⅰ)形成的絡(luò)合物溶于有機(jī)溶劑而難溶于水的性質(zhì)， 通過2,2′-聯(lián)喹啉的有機(jī)溶劑處理含甘氨酸的水溶液生物樣本將兩種不同的形態(tài)銅分離在不同的水相和有機(jī)相中， 從而可以用GFAAS法測(cè)定有機(jī)相中的Cu(Ⅰ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AA-7000型原子吸收光譜儀(島津公司， 日本)。 銅空心陰極燈， 波長(zhǎng)324.8 nm， 工作電流10 mA， 狹縫寬0.5 nm， 氘燈扣背景技術(shù)， 氣流0.2 L·min-1, 進(jìn)樣體積20 μL， 峰高定量進(jìn)樣。 ASC-7000自動(dòng)進(jìn)樣器， 涂層石墨管(日本島津公司)， 美國(guó)Millipore公司超純水器。 Eppendorf微量移液管。 旋渦振蕩器。 離心機(jī)。 所用玻璃和塑料器具用10%HNO3浸泡后用超純水清洗三次。

CuCl標(biāo)準(zhǔn)品(99.999%， 阿拉丁)； 65%HNO3(德國(guó)默克優(yōu)級(jí)純)； 30%H2O2(德國(guó)默克優(yōu)級(jí)純)； 正戊醇(德國(guó)默克優(yōu)級(jí)純)； 1 g·L-1銅標(biāo)準(zhǔn)貯備液(國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的保存及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

CuCl標(biāo)準(zhǔn)品開封后， 用10只1 mL塑料管分裝， 小心充入氬氣， 將管內(nèi)空氣驅(qū)凈后用密封膠封好管口， 并儲(chǔ)存于放有硅膠的干燥器中。 配制工作曲線時(shí)， 取出其中一管， 稱取CuCl的標(biāo)準(zhǔn)品0.015 6 g置于10 mL容量瓶， 用0.05% 2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液稀釋至刻度線， 即1 000 ppm亞Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取100 μL用2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液依次稀釋成10, 1, 0.1和0.01 ppm溶液, 取0.01 ppm溶液1 000 μL置2 mL消化管于95 ℃烘箱烘干(約5 h)， 冷至室溫后分別加入200 μL 65%硝酸和200 μL 30%雙氧水密封， 80 ℃水浴1 h， 冷至室溫后加入1 000 μL 1%HNO3， 上機(jī)時(shí)用1%HNO3作稀釋劑， 自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)稀釋成1， 2， 4， 8， 16 μg·L-1做工作曲線。

1.2.2 甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH配制

處理不含蛋白的中性水溶液樣本時(shí)， 所用甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH用 0.05 mol·L-1甘氨酸和0.5 mol·L-1NaOH配至pH為9。 用20%三氯乙酸處理含蛋白的樣本時(shí)， 由于三氯乙酸酸性較強(qiáng)， 為了使上機(jī)前的樣液pH大約為9， 所用甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH需要配到12.5(按體積比1∶3混合計(jì)算)。

1.2.3 樣本收集

宮頸癌血清由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)室提供， 健康人血清樣本由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心檢驗(yàn)室提供， 測(cè)定前儲(chǔ)存于冰箱-80 ℃。

細(xì)胞勻漿液及細(xì)胞膜液樣本制備： 人永生化肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞在DMEM/F12(1∶1，V/V)含10% NCS培養(yǎng)三天后， 去掉培養(yǎng)液， 收集細(xì)胞， 甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH， 9.0)洗滌3次。 于-80 ℃冰箱凍融三次破膜后， 15 000 g×30 min離心， 上清為胞漿液， BCA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。 沉淀再經(jīng)超聲破碎， 用700 μL 2%Triton X-100溶解， 得即細(xì)胞膜液， BCA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

1.2.4 總Cu(TCu)含量測(cè)定

按文獻(xiàn)[17]方法稍加改進(jìn)： 取100 μL血清(200 μL細(xì)胞漿液或細(xì)胞膜液)置于6 mL特氟隆消化管， 防塵措施下置烘箱80 ℃敞口烘干(約6 h)， 消解按1.2.1處理， 用1%硝酸稀釋成1 000 μL， 上機(jī)用GFAAS法測(cè)定總銅。

1.2.5 Cu(Ⅰ)含量測(cè)定

400 μL血清(細(xì)胞勻漿液、 細(xì)胞膜液)與400 μL 20%三氯乙酸混勻， 1 200轉(zhuǎn)離心10 min去蛋白， 取離心后上清液400 μL置5 mL塑料管內(nèi)， 加入1 500 μL pH為12.5的甘氨酸-NaOH緩沖溶液， 混勻后加入1 000 μL 0.05% 2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液， 旋渦振蕩1 min， 靜置分層后取有機(jī)層500 μL于6 mL特氟隆消化管， 95 ℃烘箱烘干(約5 h)， 消解按1.2.1處理， 室溫加入600 μL， 上機(jī)用GFAAS法測(cè)定Cu(Ⅰ)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 Cu(Ⅰ)的絡(luò)合試劑及其絡(luò)合物的有機(jī)溶劑選擇

血清中的蛋白經(jīng)三氯乙酸沉淀， 全部銅以兩種不同形態(tài)的銅釋放出來[15]。 其中的Cu(Ⅰ)能與2，2′-聯(lián)喹啉結(jié)合且形成的配合物易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水。 選用2，2′-聯(lián)喹啉作為Cu(Ⅰ)的絡(luò)合試劑。 考慮正戊醇是一種微溶于水的無毒有機(jī)溶劑， 與水混溶后迅速形成均勻的乳濁液， 使得溶解在其中的2，2′-聯(lián)喹啉能充分結(jié)合水相中的Cu(Ⅰ)離子， 形成的Cu(Ⅰ)配合物進(jìn)入到正戊醇中。 放置后正戊醇由于密度(0.81)比水小， 很快浮在水面上層， 水相與有機(jī)相液界面非常清晰， 無須離心。 因此， 本文采用正戊醇作Cu(Ⅰ)試劑的有機(jī)溶劑。

2.1.2 Cu(Ⅱ)離子的配合劑選擇及其濃度、 pH選擇

如圖1所示， 用含2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液與10 μg·L-1Cu(Ⅱ)的純水溶液充分蕩時(shí)， 有極少量Cu(Ⅱ)從水相轉(zhuǎn)入有機(jī)相， 對(duì)測(cè)定混存的痕量Cu(Ⅰ)時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾。 產(chǎn)生這種原因， 很可能因Cu(Ⅱ)離子與溶液中OH-或Cl-形成了低極性的配合物。 要減少這種干擾， 就必須降低Cu(Ⅱ)離子從水相轉(zhuǎn)入有機(jī)相的量。

甘氨酸分子屬于極性氨基酸， 溶于極性溶劑， 難溶于非極性溶劑 。 甘氨酸能與Cu(Ⅱ)形成穩(wěn)定的無機(jī)絡(luò)合劑， 其穩(wěn)定常數(shù)為15.1[18]。 因此選擇甘氨酸作Cu(Ⅱ)離子的配合劑。

圖1 甘氨酸對(duì)10 μg·L-1 Cu(Ⅱ)離子由水相進(jìn)入有機(jī)相的影響

圖2為混有8 μg·L-1Cu(Ⅰ)與10 μg·L-1Cu(Ⅱ)兩種離子的水相經(jīng)過甘氨酸和2，2′-聯(lián)喹啉處理后， 轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中的銅分析結(jié)果。 從圖2中可看出， 在考察的pH范圍中， 8 μg·L-1Cu(Ⅰ)絕大部分能從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中。 而Cu(Ⅱ)離子只有當(dāng)緩沖溶液pH≥8時(shí)才不會(huì)進(jìn)入到有機(jī)相， 說明pH≥8時(shí)Cu(Ⅱ)離子對(duì)Cu(Ⅰ)離子的測(cè)定基本上沒有干擾。

圖2 不同pH甘氨酸-NaOH緩沖溶液對(duì)水相中不同價(jià)態(tài)銅離子進(jìn)入有機(jī)相的影響

Fig.2 Effects of different pH glycine-NaOH buffer solutions with copper ions entering organic phase

2.2 Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

如圖3所示， 移取5 μg·L-1Cu(Ⅰ)的氯化鉀飽和溶液于10 mL塑料管內(nèi)， 蓋緊管口， 每隔1 h取出1 mL測(cè)定Cu(Ⅰ)濃度， 結(jié)果表明， 隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)， Cu(Ⅰ)濃度會(huì)漸漸降低， 7 h后濃度幾乎降低了一半。 將Cu(Ⅰ)直接溶于2，2′-聯(lián)喹啉的有機(jī)相后， 由于其與配合劑生成穩(wěn)定的配合物， 加上有機(jī)溶劑隔絕空氣中的氧， 7 h內(nèi)吸光度幾乎沒有什么變化。 因此， 短期內(nèi)Cu(Ⅰ)標(biāo)準(zhǔn)溶液可用含2，2′-聯(lián)喹啉正戊醇溶液配置。

圖3 室溫放置一天Cu(Ⅰ)在水相及有機(jī)相中的濃度變化

2.2.2 生物樣本處理過程中Cu(Ⅰ)離子的穩(wěn)定性

如圖4所示， 將血清樣品分成兩組， 一組-80 ℃低溫冰箱保存， 一組室溫下放置。 每隔一天測(cè)血清中的Cu(Ⅰ)濃度， 一周后發(fā)現(xiàn)-80 ℃低溫冰箱的血清Cu(Ⅰ)濃度基本上沒變化， 室溫下的血清Cu(Ⅰ)濃度度降低了近20%。 這可能與保護(hù)Cu(Ⅰ)不被氧化的蛋白質(zhì)降解有關(guān)， 由于血清總銅不變， 即部分Cu(Ⅰ)被氧化成了Cu(Ⅱ)。 因此， 測(cè)定生物樣品的Cu(Ⅰ)時(shí)， 新鮮的血清應(yīng)盡量及時(shí)處理， 而對(duì)于濃度極低的細(xì)胞液或細(xì)胞膜液， 則應(yīng)在當(dāng)天處理。

圖4 血清室溫放置一周的Cu(Ⅰ)濃度變化

2.3 最佳條件下考察Cu(Ⅱ)對(duì)Cu(Ⅰ)的干擾情況

圖5為pH為9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液條件下， 10， 100和1 000 μg·L-1的Cu(Ⅱ)離子從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中， 在有機(jī)相中測(cè)到的銅濃度值。 結(jié)果表明， 10倍Cu(Ⅱ)離子濃度的存在， 對(duì)Cu(Ⅰ)離子的測(cè)定不再產(chǎn)生干擾。

圖5 水相中不同濃度的二價(jià)銅進(jìn)入有機(jī)相的濃度

2.4 方法的分析性能

按1.2.1方法制作測(cè)定銅標(biāo)準(zhǔn)系列， 校準(zhǔn)曲線方程為

A=0.048c+0.000 5，R=0.999 5

按3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的檢出限(n=12)， Cu(Ⅰ)的檢出限為0.10 μg·L-1。 將一定質(zhì)量CuCl的標(biāo)準(zhǔn)加入樣品， 按1.2.5方法處理后測(cè)定Cu(Ⅰ)， 所得回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。

表1 方法回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品分析(n=5)

表2說明， 宮頸癌患者與健康者相比， 血清總銅變化不大， Cu(Ⅰ)濃度明顯偏高。

表3說明， 農(nóng)夫山泉水、 自來水及尿液檢測(cè)不到Cu(Ⅰ)， 而細(xì)胞液和細(xì)胞膜中幾乎沒有Cu(Ⅱ)離子存在。

表2 健康者與宮頸癌患者血清中Cu(Ⅰ)測(cè)定結(jié)果比較

表3 幾種樣品的亞銅和總銅含量

3 結(jié) 論

在pH為8～10的條件下， 甘氨酸與Cu(Ⅱ)形成溶于水不溶于有機(jī)溶劑的穩(wěn)定配合物甘氨酸銅， 2,2′-聯(lián)喹啉亞銅溶于有機(jī)溶劑而不溶于水， 利用此原理能將樣品中同時(shí)存在的Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)分離在不同液相， 進(jìn)而用GFAAS法可以測(cè)定血清中Cu(Ⅰ)含量。 本法可用于生物樣品中Cu(Ⅰ)離子的測(cè)定， 10倍的Cu(Ⅱ)離子對(duì)其測(cè)定無干擾。 目前定量測(cè)定生物體系中的銅仍然局限在總銅方面。 本文報(bào)道μg·L-1級(jí)Cu(Ⅰ)含量的檢測(cè)， 通過檢測(cè)， 可加深認(rèn)識(shí)和了解生物體系中銅形態(tài)的轉(zhuǎn)換及代謝失衡的變化規(guī)律， 對(duì)研究老年癡呆、 腫瘤、 炎癥等疾病狀態(tài)下Cu(Ⅰ)是否具有獨(dú)自的病理生理意義有一定的意義。