復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方配比優(yōu)選及其對(duì)小鼠的免疫活性和急性毒性研究

趙或 萬(wàn)志強(qiáng) 張榮榕 馬馨桐 王苗 邵帥 嚴(yán)銘銘 齊濱

中圖分類號(hào)R967

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1001-0408（2020）02-0196-06

DOI

10.603 9/j .issn.1 001-0408.2020.02.13

摘要 目的：優(yōu)選復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方4味組方藥材（人參、黃芪、黃精、枸杞）的最佳配伍比例，并對(duì)最佳配比提取物進(jìn)行免疫活性及急性毒性研究。方法：在采用細(xì)胞活性試驗(yàn)篩選4味藥材生藥量濃度范圍的基礎(chǔ)上，以不同生藥量濃度的藥材提取物作用后小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中的一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子cc（TNF-a）含量為指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)法確定復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方各藥材的最佳配比。取小鼠240只，隨機(jī)分為4批，每批60只，均隨機(jī)分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性藥物組[左旋咪唑，4 mg/（kg-d）]和復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物低、中、高劑量組[0.952 8、1.905 6、3.811 2g/（kg-d）]，每組10只，灌胃給藥，qd，連續(xù)給藥30 d;除空白組外，其余組小鼠于首次給藥后第24天時(shí)腹腔注射環(huán)磷酰胺[40mg/（kg·d）]，qd，連續(xù)注射3d以建立免疫低下模型。通過(guò)測(cè)定各組小鼠臟器系數(shù)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，血清溶血素、IL-2、IgM、IgG、IgA含量，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，來(lái)評(píng)價(jià)最佳配比提取物的免疫活性。另取小鼠20只，灌胃最佳配比提取物20 mL/kg，給藥2次，以經(jīng)口最大耐受劑量（ MTD）考察其急性毒性。結(jié)果：復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方的最佳配比為人參、黃芪、黃精、枸杞生藥質(zhì)量比1：2：2：4。免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方最佳配比提取物可顯著提高小鼠的臟器指數(shù)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力，血清中溶血素、IL-2、IgM、IgG、IgA含量以及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能（P<0.05或P<0.01）;急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其經(jīng)口MTD均大于15 g/kg，口服無(wú)毒性。結(jié)論：復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物可顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能，且口服無(wú)毒性。

關(guān)鍵詞 人參免疫增強(qiáng)方;藥對(duì);均勻設(shè)計(jì)法;小鼠;免疫功能;急性毒性

免疫力是人體自身的一種主動(dòng)防御機(jī)制，對(duì)維持生理和生命活動(dòng)具有十分重要的意義。在正常生理情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)依賴其先天具有的固有免疫和后天獲得的適應(yīng)性免疫共同發(fā)揮免疫作用，使機(jī)體的生理功能保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài);若機(jī)體免疫功能出現(xiàn)異常將會(huì)導(dǎo)致如過(guò)敏反應(yīng)、自身免疫性疾病等不良后果，免疫力低下的人群更容易受到疾病的侵襲[1-2]。因此，研究開發(fā)安全、高效的具有免疫調(diào)節(jié)功效的藥物以提高人們的免疫力，具有重要的臨床意義。

中醫(yī)藥臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明，人參、黃芪、靈芝、枸杞、當(dāng)歸、黃精、川芍等多種中藥具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)[3-7]。多種中藥活性成分均具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括糖類、苷類、生物堿類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類等[8-12]。復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方是本課題組與長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院多位免疫學(xué)、中藥學(xué)等領(lǐng)域的專家共同協(xié)商，根據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)組方而得的方劑[13-16]。該方中人參和黃芪作為補(bǔ)氣藥對(duì)，兩者共用具有補(bǔ)五臟之氣、扶衛(wèi)陽(yáng)之氣、清心內(nèi)固的功效;枸杞和黃精作為補(bǔ)血藥對(duì)，兩者共用可達(dá)到補(bǔ)氣生血的功效[7-9]。復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方由兩組藥對(duì)聯(lián)合配伍而成，以期達(dá)到氣血雙補(bǔ)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。

本研究采用均勻設(shè)計(jì)法分組設(shè)計(jì)，以RAW264.7巨噬細(xì)胞中一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子a（TNF-a）含量為指標(biāo)篩選復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方各組方藥材的最佳配比;建立小鼠免疫低下模型，考察該方最佳配比提取物對(duì)小鼠各免疫指標(biāo)的影響，以評(píng)價(jià)其免疫增強(qiáng)活性;同時(shí)，考察該提取物對(duì)小鼠的急性毒性，旨在為開發(fā)一種高效、安全的增強(qiáng)免疫力的中藥復(fù)方制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3111型C02培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Infinite M200PRO型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;ALB-224型萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;Stemi 508型倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）;BPZ-LC型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;DZTW型電子調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)磷酰胺原料藥（上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：20180601，純度：>98%）;鹽酸左旋咪唑片（北流市銅州藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170701，規(guī)格：25 mg）;胎牛血清（澳洲Cellmax公司）;脂蛋白（LPS，批號(hào)：320V0313）、DMEM高糖培養(yǎng)基、刀豆蛋白（ConA）、噻唑藍(lán)（MTT）、Hank's液、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、臺(tái)盼藍(lán)染色劑、2一巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、水楊酸（SA）緩沖液、都氏試劑、Giemsa染液、豚鼠血清均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;NO檢測(cè)試劑盒以及IL-6、TNF-a、IL-2、血清免疫球蛋白（IgM、IgG、IgA）酶聯(lián)免疫吸附（EIISA）試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司;鹽酸、異丙醇、丙酮、甲醇等試劑均購(gòu)自北京化工廠;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格;水為蒸餾水。

1.3 藥材飲片

人參飲片（批號(hào)：20170328）購(gòu)自吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司;黃芪飲片（批號(hào)：20170605）、枸杞飲片（批號(hào)：20170713）、黃精飲片（批號(hào)：20171026）均購(gòu)自酒泉市培豐中藥材有限公司。

1.4 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司;雞紅細(xì)胞（上海源葉生物科技有限公司）;綿羊血紅細(xì)胞（SRBC，北京索萊寶科技有限公司）。

1.5 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠260只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。

2 方法

2.1 藥材提取物制備

復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方的4味組方藥材的單味提取物由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥保健食品科技創(chuàng)新中心制備：取人參飲片50 g，水煎3次，每次1h，合并3次水煎提取液，濃縮，減壓干燥，粉碎，即得人參提取物粉末;同法制備黃芪、黃精、枸杞飲片提取物粉末。人參、黃芪、黃精、枸杞4味飲片提取物得率分別為12%、14%、15%、20%。

2.2 組方藥材生藥量濃度范圍篩選

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取RAW264.7細(xì)胞，以含100 U/mL青霉素一鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）在37℃、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日傳代。

2.2.2 提取物藥液配制取“2.1”項(xiàng)下各味藥材提取物粉末適量，以DMEM高糖培養(yǎng)基為溶劑配制人參提取物質(zhì)量濃度分別為0.12、0.18、0.36、0.54、0.72、0.90、1.08、1.44、1.80、2.40 mg/mL，黃芪提取物質(zhì)量濃度分別為0.14、0.21、0.42、0.63、0.84、1.05、1.26、1.68、2.10、2.80mg/mL.黃精提取物質(zhì)量濃度分別為0.15、0.225、0.45、0.675、0.90、1.125、1.35、1.80、2.25、3.00 mg/mL，枸杞提取物質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4、3.O、4.O mg/mL的藥液（按各藥材飲片的提取率換算，均分別相當(dāng)于原生藥材質(zhì)量濃度為1、1.5、3、4.5、6、7.5、9、12、15、20 mg/mL）。

2.2.3 4味藥材生藥量濃度范圍篩選采用CCK-8法測(cè)定各味藥材提取物作用后RAW264.7細(xì)胞的增殖率，并根據(jù)細(xì)胞增殖率變化趨勢(shì)篩選生藥量濃度。取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5X10⁴個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為陰性對(duì)照組和提取物組，陰性對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基100 μL/孔，提取物組分別加入“2.2.2”項(xiàng)下不同濃度的各味藥材提取物藥液100 μL/孔;另設(shè)不加細(xì)胞、僅加入完全培養(yǎng)基200 μL/孔的空白組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，每孔均先后加入無(wú)血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基100μL和CCK-8試劑10 μL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)1h。培養(yǎng)完畢后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度（OD）值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（提取物組細(xì)胞OD值一空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值一空白組OD值）XlOO%。

2.3 組方藥材最佳配比優(yōu)選

2.3.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案采用均勻設(shè)計(jì)法[11]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以人參、黃芪、黃精、枸杞各飲片的生藥量濃度（分別表示為X1、X2、X3、X4，g/mL）為因素，并基于“2.2”項(xiàng)下篩選獲得的上述4味組方藥材的生藥量濃度范圍選取7個(gè)濃度梯度為不同水平，根據(jù)U7（74）表設(shè)計(jì)藥材配比試驗(yàn)。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案詳見表1。

2.3.2 細(xì)胞因子試驗(yàn)優(yōu)選組方藥材生藥量的最佳配比

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按5X10⁴個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和均勻設(shè)計(jì)配比1～7組，空白對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入10μg/mL的LPS溶液（以完全培養(yǎng)基配制），均勻設(shè)計(jì)配比1～7組按表1方案（各水平均按生藥量計(jì)）加入4種藥材提取物混合物藥液（以完全培養(yǎng)基配制），每孔100 μL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔平行試驗(yàn)。收集各組細(xì)胞上清液，采用相應(yīng)試劑盒按說(shuō)明書方法操作，檢測(cè)NO、IL-6、TNF-a含量。以人參、黃芪、黃精、枸杞的生藥量濃度（X1、X2、X3、X4）為自變量，以NO、IL-6、TNF-a含量為因變量（y），進(jìn)行多元逐步回歸分析并得出各指標(biāo)的回歸方程。當(dāng)y取最大值時(shí)，即NO、IL-6、TNF-a含量最高時(shí)，表示所對(duì)應(yīng)的藥材配比可達(dá)到最佳藥物效應(yīng)。

2.4 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物的免疫活性考察

2.4.1最 佳配比提取物制備按照“2.3”項(xiàng)下優(yōu)選出的復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方各組方藥材的最佳配比（質(zhì)量比1：2：2：4）.稱取人參1.5 g、黃芪3 g、黃精3 g、枸杞6 g（人日服處方量）藥材飲片混合后，按“2.1”項(xiàng)下方法制備最佳配比復(fù)方提取物粉末（以下簡(jiǎn)稱“復(fù)方提取物”），以水配制成相應(yīng)濃度藥液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 動(dòng)物分組、造模及給藥取小鼠240只，隨機(jī)分為4批，每批60只。每批小鼠均隨機(jī)分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性藥物組[左旋咪唑，4mg/（kg.d），參照文獻(xiàn)方法[18]設(shè)置劑量]和復(fù)方提取物低、中、高劑量組[0.952 8、1.905 6、3.811 2 g/（kg.d），以提取物質(zhì)量計(jì)算，分別相當(dāng)于人日服處方量的10、20、30倍]，每組10只。各組小鼠分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)藥液，灌胃體積為10 mL/kg，qd，連續(xù)給藥30 d。除空白組外，其余組小鼠自開始給藥起第24天時(shí)腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/（kg.d），qd，連續(xù)注射3d，以建立免疫低下模型。給藥結(jié)束后，各批小鼠分別進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)或考察。

2.4.3小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的測(cè)定取“2.4.2”項(xiàng)下第1批小鼠，于末次灌胃給藥后禁食15 h，稱定體質(zhì)量后，脫頸處死;無(wú)菌條件下取其脾臟、胸腺，稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)（胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量XlOO%;脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量XlOO%）。

2.4.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力考察采用脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)考察小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力。取“2.4.3”項(xiàng)下小鼠脾臟，置于裝有適量Hanks液的平皿中，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，濾過(guò)，以1 000 r/min離心10min，棄去上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3x106個(gè)/mL。每份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔板中，每孔1 mL，然后一孔加入ConA試液75 μL，另一孔加入含100 U/mL青一鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液75 μL作為對(duì)照孔。細(xì)胞置于37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔吸棄上清0.7 mL，另加入不含血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基0.7 mL和5 mg/mL的MTT試液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束;然后每孔細(xì)胞加入酸性異丙醇1 mL，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。采用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，以光密度差值表示脾淋巴細(xì)胞的增殖能力（光密度差值= ConA誘導(dǎo)孔OD值一對(duì)照孔OD值），光密度差值越大，則表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

2.4.5 小鼠血清溶血素含量測(cè)定取“2.4.2”項(xiàng)下第2批小鼠，在灌胃給藥第25天時(shí)，腹腔注射4% SRBC懸液（以生理鹽水配制）0.2 mL，qd，連續(xù)注射3d。于末次灌胃給藥后th時(shí)，眼球取血，收集血清。血清以SA緩沖液稀釋200倍后，取1 mL置于試管內(nèi)，依次加入4%SRBC懸液0.5 mL、補(bǔ)體（取SRBC 1 mL、豚鼠血清5 mL混勻，4℃冷藏后取上清液，以8倍體積SA緩沖液稀釋，即得）1 mL;同時(shí)設(shè)置不加血清的空白對(duì)照管（以SA緩沖液代替）。將試管置于37℃水浴中保溫20 min，在冰浴中終止反應(yīng)，以2 000 r/min離心10 min;取上清液1mL，加都氏試劑3 mL，充分混勻，放置10 min，采用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。另取4%SRBC細(xì)胞懸液0.25 mL，加入都氏試劑3.75 mL混勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定SRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸收度[19]。以半數(shù)溶血值（ HCso）表示血清溶血素含量，按公式計(jì)算：HC50=（樣品管吸收度一空白對(duì)照管吸收度）/（SRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸收度一空白對(duì)照管吸收度）×稀釋倍數(shù)。

2.4.6 小鼠血清中IL-2、IgM、IgG、IgA含量測(cè)定取“2.4.2”項(xiàng)下第3批小鼠，于末次灌胃給藥后th時(shí)，眼球取血，收集血清。采用相應(yīng)ELISA試劑盒，按說(shuō)明書要求操作測(cè)定血清中IL-2、IgM、IgG、IgA的含量。

2.4.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定取“2.4.2”項(xiàng)下第4批小鼠，于末次灌胃給藥后1h時(shí)腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液（生理鹽水配制）1 mL，30 min后脫頸處死，取其仰臥位固定于鼠板中，腹腔注射生理鹽水2 mL，以適當(dāng)速度轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。吸取小鼠腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，在37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，在生理鹽水中漂洗，晾干;加入丙酮一甲醇混合液（1：1，V/V）固定，以4%Giemsa的PBS溶液染色3min，再以水漂洗，晾干。在油鏡下對(duì)巨噬細(xì)胞（鏡下紫紅色為細(xì)胞核染色，藍(lán)紫色為細(xì)胞質(zhì)染色）計(jì)數(shù)，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)[吞噬百分率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)XlOO%;吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/巨噬細(xì)胞數(shù)]。

2.5 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物的急性毒性考察

參照本課題組前期研究[20]并進(jìn)行改良實(shí)驗(yàn)。取小鼠20只，灌胃復(fù)方提取物藥液（以水配制成0.40 g/mL的藥液，以提取物計(jì)算），每次20 mL/kg，灌胃2次，給藥間隔6h（相當(dāng)于人推薦日攝入量的178倍）。連續(xù)觀察14d，觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化、中毒特征以及死亡情況等，測(cè)定半數(shù)致死量（ LDso）和最大耐受劑量（MTD）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.O統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用方差分析;采用逐步回歸分析對(duì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方組方藥材生藥量濃度范圍

細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，人參生藥量濃度為1.5～4.5 mg/mL（相當(dāng)于提取物0.18～0.54 mg/mL）、黃芪生藥量濃度為3～12 mg/mL（相當(dāng)于提取物0.42～1.68mg/mL）、黃精生藥量濃度為3～9 mg/mL（相當(dāng)于提取物0.45～1.35 mg/mL）、枸杞生藥量濃度為3～6 mg/mL（相當(dāng)于提取物0.6～1.2 mg/mL）時(shí)，細(xì)胞增殖率呈上升趨勢(shì)，因此在上述濃度范圍內(nèi)進(jìn)行后續(xù)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)。不同生藥濃度的組方藥材對(duì)細(xì)胞活性的影響見圖1。

3.2 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方組方藥材最佳配比

細(xì)胞因子試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)配比1～7組細(xì)胞中NO、IL-6、TNF-a的含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，得出各指標(biāo)回歸方程，NO、IL-6、TNF-a含量水平越高，即Y取值越大時(shí)，該方增強(qiáng)免疫力效果越好。回歸分析結(jié)果見表3。

由表3結(jié)果換算，復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方的最佳配比為：人參、黃芪、黃精、枸杞生藥質(zhì)量比1：2：2：4。

3.3 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物的免疫活性

3.3.1 小鼠臟器指數(shù)與空白組比較，模型組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，阻性藥物組和復(fù)方提取物低、中、高劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.01），詳見表4。

3.3.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力與空白組比較，模型組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P<0.01）;與模型組比較，阻性藥物組和復(fù)方提取物低、中、高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.01），詳見表5。

3.3.3 小鼠血清溶血素含量與空白組比較，模型組小鼠血清溶血素含量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方提取物低、中、高劑量組小鼠血清溶血素含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

3.3.4 小鼠血清中IL-2、IgM、IgG、IgA含量與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-2、IgA、IgM、IgG含量均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方提取物低、中、高劑量組小鼠血清中上述指標(biāo)含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表6。

3.3.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能與空白組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方提取物低、中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表7。

3.4 復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方最佳配比提取物對(duì)小鼠的急性毒性

給藥14 d內(nèi)，小鼠外觀、行為、體質(zhì)量、食欲等均正常，無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生，故無(wú)法測(cè)得LD50值;復(fù)方提取物對(duì)不同性別小鼠的經(jīng)口MTD均大于15 g/kg，表明口服無(wú)毒性，詳見表8。

4 討論

藥對(duì)是中醫(yī)臨床遣藥組方的常用配伍形式，是歷代醫(yī)藥學(xué)家長(zhǎng)期醫(yī)療實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。其組成簡(jiǎn)單卻具備中藥配伍的基本特征，兩藥物配伍后可能形成新的功效方向，或促進(jìn)原有作用以增強(qiáng)療效，或同用后相互兼治復(fù)雜病癥等，從而發(fā)揮協(xié)同增效或配伍減毒的作用[21-24]。藥對(duì)配伍可以為組建新方提供依據(jù)。許多方劑的主要功效很可能是由一個(gè)或幾個(gè)藥對(duì)來(lái)承擔(dān)，其他藥味可能只是起到輔助作用;有些藥對(duì)本身就是方劑，也可以一起作為君藥，還可以針對(duì)病機(jī)在中醫(yī)理論指導(dǎo)下作為輔助藥物組合在方劑中配伍其他藥對(duì)[25-26]。復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方是以藥對(duì)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合中醫(yī)藥理論，將兩組藥對(duì)聯(lián)合應(yīng)用，以期達(dá)到補(bǔ)氣生血、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的療效。

均勻設(shè)計(jì)法是將多元統(tǒng)計(jì)和數(shù)論結(jié)合開發(fā)出的一種適用于多因素、多水平的一種設(shè)計(jì)方法，可有效減少實(shí)驗(yàn)次數(shù);其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可采用計(jì)算機(jī)軟件處理，并通過(guò)回歸分析得出結(jié)論，目前已被廣泛用于復(fù)方藥物篩選研究[27]。細(xì)胞因子IL-6、TNF-a主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，并能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)以及損傷組織修復(fù)等多種功能;巨噬細(xì)胞內(nèi)NO是通過(guò)一氧化氮合酶途徑合成，其合成能力與抗炎作用密切相關(guān)，生物活性效應(yīng)分子NO的分泌與釋放，能使巨噬細(xì)胞有效識(shí)別腫瘤等靶細(xì)胞，在信息傳遞、激活與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[28-29]。因此，本研究通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO、IL-6、TNF-a含量為指標(biāo)進(jìn)行體外免疫活性研究，經(jīng)優(yōu)選得到復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方的最佳配比為人參、黃芪、黃精、枸杞生藥質(zhì)量比1：2：2：4。

本研究通過(guò)建立免疫低下小鼠模型，從體內(nèi)層面考察該方最佳配比提取物的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，最佳配比提取物具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用，可顯著提高免疫低下小鼠的臟器指數(shù)，增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高血清溶血素、IL-2、IgM、IgG、IgA含量以及單核一巨噬細(xì)胞的吞噬功能。這表明優(yōu)選獲得的最佳配比提取物在細(xì)胞免疫與體液免疫方面均具有增強(qiáng)作用，可為相關(guān)免疫復(fù)方制劑的開發(fā)研究提供依據(jù)。此外，通過(guò)小鼠急性毒性試驗(yàn)初步證實(shí)該方口服安全無(wú)毒。

綜上所述，復(fù)方人參免疫增強(qiáng)方的最佳配比為人參、黃芪、黃精、枸杞生藥質(zhì)量比1：2：2：4;該方提取物可有效增強(qiáng)免疫低下模型小鼠的免疫功能且口服無(wú)毒，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。但由于中藥材的有效成分受藥材產(chǎn)地、采收期及飲片炮制方法的影響，故存在含量上的差異，而藥材配伍比例的效果是否同樣受上述因素影響，尚有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-06-13修回日期：2019-12-02）

（編輯：段思怡）

△基金項(xiàng)目：吉林省科技成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（No.20170311030YY）;吉林省科技條件與平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.20180623041TC）;吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（No.JJKH20181276KJ，No.JJKH20190482KJ）

*碩士研究生。研究方向：中藥化學(xué)、新藥開發(fā)。E-mail：435307889@qq.com

#a通信作者：教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥物化學(xué)、中藥化學(xué)、新藥開發(fā)。E-mail： 386759102@qq.com

#b通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥物化學(xué)、中藥化學(xué)、新藥開發(fā)。E-mail： 24328678@qq.com