禽呼吸道7種病毒多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用

周瑩珊，陳 琳，周 柯，王雨萌，邵春艷，楊永春，黃保續(xù)，王曉杜*，宋厚輝*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032)

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，禽類養(yǎng)殖量位居世界前列，養(yǎng)殖量約為120億只[1]。H9、H5、H7亞型禽流感及新城疫、禽偏肺病毒病、傳染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎是嚴(yán)重危害我國(guó)禽業(yè)發(fā)展的7種最重要的禽病毒性呼吸道疾病[2]。這7種病原多呈現(xiàn)混合感染的態(tài)勢(shì)，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，并且混合感染也很難通過(guò)臨床癥狀和病理變化對(duì)致病原因進(jìn)行確診。目前尚沒(méi)有一種方法可以一次性對(duì)引起禽呼吸道疾病的這7種病毒進(jìn)行鑒別檢測(cè)。因此建立一種能精準(zhǔn)快速區(qū)分不同病毒的檢測(cè)方法，對(duì)于禽呼吸道疾病的預(yù)防和早期干預(yù)至關(guān)重要。

多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)最早是由SCHOUTEN等[3]于2002年首次報(bào)道，是一種結(jié)合核酸雜交和PCR擴(kuò)增的高通量多重核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)在同一反應(yīng)管中可對(duì)多達(dá)40個(gè)不同的靶基因進(jìn)行檢測(cè)分析。MLPA的基本程序包括左右探針?lè)謩e與靶序列DNA雜交，連接酶連接左右探針，生成一條兩端分別含有通用引物的長(zhǎng)度唯一的全長(zhǎng)探針，PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)探針并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳后得到數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[4]。

本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)引起禽呼吸道感染的7種病毒的MLPA檢測(cè)技術(shù)，為禽呼吸道病毒的鑒別診斷和應(yīng)急檢測(cè)提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品和感染陽(yáng)性組織122份禽鼻腔拭子樣品來(lái)自浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物健康檢測(cè)中心和中國(guó)科學(xué)院流感研究與預(yù)警中心監(jiān)測(cè)網(wǎng)點(diǎn)。禽流感H9、H5、H7亞型病毒陽(yáng)性組織及新城疫病毒陽(yáng)性組織、禽偏肺病毒陽(yáng)性組織、傳染性支氣管炎病毒陽(yáng)性組織和傳染性喉氣管炎病毒陽(yáng)性組織均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑MEGAscript T7試劑盒購(gòu)自Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO(上海東洋紡)；One Step Ahead RT-PCR Kit購(gòu)自QIAGEN公司；DNA/RNA共提取試劑盒購(gòu)自Tiangen生物技術(shù)有限公司；pGEM-5zf載體購(gòu)自Promega公司；SALSA MLPA EK1 Reagent Kit(MRC Holland)購(gòu)自廈門致善生物科技有限公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank收錄的病毒全基因組序列，利用Geneious 8.1.4軟件進(jìn)行序列比對(duì)尋找高度保守區(qū)域的基因。用Primer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，用于特異性反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增，這些引物擴(kuò)增的片段包含MLPA探針結(jié)合的區(qū)域。探針設(shè)計(jì)參照Designing synthetic MLPA probes，Version 15(www.mlpa.com)。探針?lè)謩e結(jié)合AIV H9、H5、H7亞型的HA基因及NDV的M基因、aMPV的N基因、IBV的M基因中、ILTV的糖蛋白C(Glycoprotein C)基因高度保守區(qū)域(表2)。左側(cè)探針(left probe，LP)由兩段核苷酸組成，一段是用于PCR擴(kuò)增的通用序列，另一段是病毒特異性序列(left hybridising sequence，LHS)；右側(cè)探針(right probe，RP)由兩段核苷酸組成，一段是病毒特異性序列(right hybridising sequence，RHS)，另一段是用于PCR擴(kuò)增的通用序列，右側(cè)探針的5′端進(jìn)行磷酸化處理。通過(guò)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的探針區(qū)分不同病原。引物和探針均由金唯智(蘇州)生物有限公司合成。

表1 反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增引物名稱和序列

表2 MLPA探針針對(duì)的靶基因及左側(cè)探針和右側(cè)探針序列

1.4 陽(yáng)性質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備將AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV的靶基因經(jīng)PCR擴(kuò)增純化回收后的目的片段克隆至pGEM-5zf載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌，PCR鑒定陽(yáng)性的菌液經(jīng)測(cè)序正確后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將包含AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV核酸的重組質(zhì)粒線性化之后，用Ambion公司的MEGAscript T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用LiCl沉淀，70%乙醇洗滌后溶于無(wú)RNase的ddH2O中，核酸電泳檢測(cè)RNA合成的完整性和正確性，并測(cè)定RNA濃度。

1.5 樣品核酸的提取和cDNA的制備用DNA/RNA共提取試劑盒提取樣品中的DNA和RNA，得到100 μL樣品。按照One Step Ahead RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：50℃ 10 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，57℃ 20 s，72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。

1.6 MLPA反應(yīng)MLPA反應(yīng)程序嚴(yán)格按照SALSA MLPA EK1 Reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每管加入1.5提取中DNA 1 μL和4 μL TE溶液，98℃變性5 min，降至室溫25℃。再加入1.5 μL MLPA緩沖液和1.5 μL探針混合液(每條探針終濃度為1.33 nmol/L)，95℃溫育1 min，60℃雜交1 h，54℃溫育。加入32 μL連接酶混合物，54℃溫育15 min，98℃加熱5 min滅活連接酶，20℃溫育。室溫下加入10 μL PCR混合物。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃孵育20 min，降至15℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用全自動(dòng)核酸分析儀(Qsep100 DNA Analyzer，BIOptic)進(jìn)行分析。

1.7 特異性測(cè)試

1.7.1單一探針特異性測(cè)試 分別以AIV H9，H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV病毒核酸和無(wú)病毒對(duì)照為模板進(jìn)行MLPA擴(kuò)增，對(duì)每種病毒探針和對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)，驗(yàn)證不同病毒之間是否會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.7.2混合探針特異性測(cè)試 用針對(duì)7種病毒混合的探針?lè)謩e對(duì)AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無(wú)病毒對(duì)照為模板進(jìn)行MLPA擴(kuò)增。測(cè)試混合探針能否從各自的病毒核酸中擴(kuò)增出單一的特異性擴(kuò)增峰，驗(yàn)證探針混合之后是否會(huì)引起非特異性交叉反應(yīng)。

1.8 靈敏度測(cè)試將上述已知濃度的AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV的RNA和ILTV的DNA溶液各進(jìn)行10倍梯度稀釋進(jìn)行MLPA反應(yīng)，分別確定其檢測(cè)極限，按以下公式計(jì)算拷貝數(shù)：(Copies/μL)=(6.02×1023Copies/mol)×質(zhì)量濃度(g·L-1)/MW(g·mol-1)。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)臨床樣品按照前述方法提取樣品總核酸，用本研究建立的MLPA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。AVI H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV分別用相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證MLPA方法與現(xiàn)有核酸檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 探針特異性測(cè)試結(jié)果分別以AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無(wú)病毒對(duì)照為模板，利用相應(yīng)的特異性探針進(jìn)行MLPA擴(kuò)增。結(jié)果顯示，單一探針只能從對(duì)應(yīng)病毒核酸中擴(kuò)增得到特異性條帶，條帶大小分別為92,97，102，120，127，134，142 bp，均與預(yù)期一致(圖1)，表明本研究所設(shè)計(jì)的7種病毒MLPA探針及對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系特異性良好，都只能檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的目的病毒核酸，與其他病毒核酸無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 單一探針特異性MLPA擴(kuò)增結(jié)果 A.H9探針；B.H5探針；C.H7探針；D.NDV探針；E.aMPV探針；F.IBV探針；G.ILTV探針。1～7.H9、H5、H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV模板；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量；NC.陰性對(duì)照。

分別以AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無(wú)病毒對(duì)照為模板，用7種病毒的混合探針進(jìn)行MLPA擴(kuò)增。結(jié)果顯示，AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV分別在約92,97,102,120,127,134,142 bp處有特異性擴(kuò)增峰，與預(yù)期相符(圖2),表明7種探針混合后其特異性沒(méi)有受到影響，檢測(cè)某一種病毒核酸時(shí)只能擴(kuò)增出單一的特異性擴(kuò)增峰，無(wú)病毒對(duì)照無(wú)擴(kuò)增峰。

圖2 混合探針特異性擴(kuò)增結(jié)果 A.峰圖;B.膠圖

2.2 7種病毒核酸混合物的MLPA擴(kuò)增結(jié)果以7種病毒混合核酸為模板進(jìn)行MLPA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，1個(gè)MLPA反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增出了大小約92,97,102,120,127,134,142 bp的7條特異性條帶，分別對(duì)應(yīng)于AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的基因片段，與預(yù)期擴(kuò)增大小相符合(圖3),表明建立的MLPA可以同時(shí)檢測(cè)到模板中的這7種病毒核酸。

圖3 7種病毒核酸混合物的MLPA擴(kuò)增結(jié)果

2.3 靈敏度測(cè)試結(jié)果以不同稀釋度的核酸作為模板進(jìn)行MLPA擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該方法最低檢測(cè)到的AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV 7種病毒核酸的拷貝數(shù)分別約為1.4×102,1.4×102,1.4×102,1.33×101,1.42×101,1.25×102,5.3×100拷貝/反應(yīng),表明該方法對(duì)7種病毒核酸檢測(cè)靈敏度均較高。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)122份臨床樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增后進(jìn)行7重MLPA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，AIV H7核酸陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)為2份，NDV陽(yáng)性樣本12份，aMPV陽(yáng)性樣本36份，IBV陽(yáng)性樣本8份，ILTV陽(yáng)性樣本17份，未檢出H5或H9陽(yáng)性樣本(表3)。MLPA檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致,表明MLPA方法的特異性、敏感性較好(表4)。AIV H5和H9由于缺乏陽(yáng)性樣品，無(wú)法計(jì)算敏感性。

表3 122份臨床病料中MLPA檢測(cè)方法與 PCR檢測(cè)方法的結(jié)果分析

表4 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比MLPA檢測(cè)方法敏感性與特異性結(jié)果分析

3 討 論

動(dòng)物疾病多重檢測(cè)技術(shù)的研究近年來(lái)已經(jīng)成為動(dòng)物病原學(xué)診斷、疫情監(jiān)測(cè)、疫病控制領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)在人類基因或基因片段的缺失或重復(fù)，染色體重排，單核苷酸多態(tài)性和點(diǎn)突變，基因乙?；恐械玫綇V泛應(yīng)用[5-6]，但是在病毒檢測(cè)尤其是動(dòng)物病毒的高通量檢測(cè)中應(yīng)用較少[7]。

為了提高M(jìn)LPA檢測(cè)的靈敏度，本研究增加了反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增過(guò)程，使得原本需要雜交16 h縮短為雜交1 h即可，極大地縮短了反應(yīng)時(shí)間[8]。MLPA技術(shù)的關(guān)鍵是引物的設(shè)計(jì)[9]。本研究針對(duì)病毒高度保守的基因設(shè)計(jì)了7對(duì)探針，每種探針只能擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的病毒片段，特異性好，不同探針之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。為了易于區(qū)分不同病毒，每個(gè)病毒的核酸片段大小區(qū)分至少在5 bp以上。由于MLPA擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度差距比較小，一般凝膠電泳無(wú)法區(qū)分，檢測(cè)結(jié)果需要進(jìn)行毛細(xì)管電泳才能分離。通過(guò)設(shè)立陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，可以通過(guò)讀取擴(kuò)增片段的堿基數(shù)直接進(jìn)行結(jié)果的判定[10]。

綜上所述，本研究建立了一種鑒別檢測(cè)AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV共7種病毒的高通量檢測(cè)技術(shù)。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，可以為禽呼吸道病毒性疾病的鑒別診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。