蝦黑變形成機(jī)制及其抑制方法研究進(jìn)展

林婷 楊勝平 謝晶 錢韻芳

摘要：蝦等甲殼類水產(chǎn)品在貯運(yùn)過程中容易發(fā)生黑變，影響了其感官特性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蝦等甲殼類水產(chǎn)品的黑變現(xiàn)象通常與其體內(nèi)多酚氧化酶（PPO）的作用有關(guān)，在PPO催化下，蝦體內(nèi)的酪氨酸被氧化為醌，進(jìn)而發(fā)生聚合沉積。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外蝦黑變的形成機(jī)制及抑制蝦黑變方法的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為蝦貯藏保鮮技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)提供參考。

關(guān)鍵詞：蝦;多酚氧化酶;黑變;抑制方法

中圖分類號(hào)：TS254.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）06-1605-07

Abstract：The crustacean aquatic products such as shrimps are prone to blackening during storage and transportation， which affects their sensory characteristics and economic value. The melanosis of crustacean aquatic products such as shrimps is usually related to the functions of polyphenol oxidase （PPO） in their bodies. Under the catalysis of PPO， tyrosine in shrimp is oxidized into quinone and then polymerized and deposited. This article summarized the domestic and overseas research progress on the formation mechanism of shrimps blackening and the anti-melanosis methods， in order to provide reference for the development and improvement of storage and preservation technology of shrimps.

Key words：shrimp;polyphenol oxidase;blackening;inhibition methods

全球甲殼類水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)一直具有很高的市場(chǎng)價(jià)值。甲殼類水產(chǎn)品蝦中富含的蝦青素具有抗氧化、抑制炎癥及調(diào)節(jié)免疫活性等多種生物功能。由于蝦自身存在大量水分、蛋白質(zhì)及游離氨基酸等，為加快自溶、酶促褐變、脂質(zhì)氧化等反應(yīng)及微生物繁殖提供了有利條件[1]。甲殼類動(dòng)物在處理加工、儲(chǔ)藏運(yùn)輸及銷售過程中產(chǎn)生的黑變現(xiàn)象，對(duì)其感官特性和消費(fèi)者的可接受性造成了不利影響，是甲殼類動(dòng)物貨架期縮短的主要因素，大大降低了甲殼類動(dòng)物的品質(zhì)和市場(chǎng)價(jià)值。因此，如何抑制黑變是甲殼類水產(chǎn)品蝦捕撈后貯藏和后續(xù)加工工業(yè)在發(fā)展中的關(guān)鍵點(diǎn)[2]。隨著消費(fèi)者對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，人們對(duì)食品質(zhì)量安全的要求更加嚴(yán)格，開發(fā)天然安全的蝦類抑黑變保鮮劑遇到瓶頸的主要原因是目前關(guān)于對(duì)蝦類黑變的發(fā)生機(jī)制尚不清晰。本文對(duì)近年來有關(guān)蝦類黑變發(fā)生機(jī)制和多酚氧化酶（PPO）特性的研究結(jié)果進(jìn)行綜述，以期為抑制蝦類黑變及促進(jìn)蝦類貯藏保鮮技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1蝦黑變的產(chǎn)生過程

在貯藏過程中，蝦體表會(huì)出現(xiàn)黑斑，即“黑變現(xiàn)象”，該過程起始于蝦的頭胸部和腹部外骨骼，而后持續(xù)擴(kuò)散到蝦的尾部區(qū)域，黑變主要出現(xiàn)在蝦關(guān)節(jié)處表層部分與腹部游泳肢連接的體節(jié)表層區(qū)域[3-4]。該黑變的出現(xiàn)與一種稱為“黑色素”的復(fù)雜物質(zhì)沉積有關(guān)。黑色素是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要色素，是酚或吲哚化合物通過氧化聚合產(chǎn)生的帶負(fù)電荷、相對(duì)分子質(zhì)量較高的疏水性大分子物質(zhì)，具有對(duì)紫外線照射和高溫穩(wěn)定、易被氧化劑漂白的特性，不溶于水、甲醇、乙醇等[5]。常見的黑色素可分為兩大類：呈深棕色或黑色、不含硫的真黑色素，呈黃色或微紅棕色、含硫的脫黑色素[5]。在生物體中，黑色素能夠促進(jìn)無脊椎動(dòng)物的角質(zhì)層硬化、血塊形成，并能維持腸道穩(wěn)態(tài)[6]，從而影響無脊椎動(dòng)物的非特異性免疫。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)基本了解蝦黑變發(fā)生的生物化學(xué)過程，與其相關(guān)的酶促褐變反應(yīng)主要是在有氧條件下由多酚氧化酶催化生物體中的酪氨酸氧化成L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA），而后L-DOPA轉(zhuǎn)變成醌類物質(zhì)[7]，并進(jìn)一步氧化成深棕色的黑色素或者參與蛋白質(zhì)官能團(tuán)的聚合反應(yīng)，形成交聯(lián)聚合物，最終呈現(xiàn)為深色的黑色素[8]，詳見圖1[5]。該反應(yīng)是在酶促褐變和自發(fā)的非酶促反應(yīng)共同作用下進(jìn)行的，其中參與酶促反應(yīng)的多酚氧化酶是形成黑色素的限速酶[8]。

2多酚氧化酶

多酚氧化酶是一種廣泛分布于自然界的含銅氧化還原酶，大部分分布在蝦血液、頭胸部和關(guān)節(jié)處等。多酚氧化酶是海洋無脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分，參與免疫防御和傷口愈合，并能促進(jìn)外骨骼硬化[9]，在蝦非特異性免疫系統(tǒng)中具有相當(dāng)重要的作用，是其抵御外來病原感染的首要防線。

2.1多酚氧化酶的分類

多酚氧化酶又稱酚氧化酶，其活性中心由2個(gè)銅離子組成并呈現(xiàn)為正四棱錐狀，通過與氧分子和底物相連的方式產(chǎn)生生物化學(xué)反應(yīng)[10]。廣義上的PPO常根據(jù)催化底物的不同分成以下3類：?jiǎn)畏友趸竅酪氨酸酶（Tyrosinase）， 國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)：EC.1.14.18.1]、雙酚氧化酶[兒茶酚氧化酶（Catechol oxidse）， 國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)：EC.1.10.3.2]和漆酶（Laccase， 國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)：EC.1.10.3.1）。通常意義上的多酚氧化酶兼具單酚酶和雙酚酶活性[11]，而漆酶具有3個(gè)銅氧化酶結(jié)構(gòu)域，可以催化鄰二酚類底物和對(duì)二酚類底物，但不能催化單酚類底物[12]。

2.2多酚氧化酶的酶原激活系統(tǒng)

在新鮮的活蝦體內(nèi)，多酚氧化酶的活性中心為Cu+與Cu2+，二者在平衡狀態(tài)下表現(xiàn)為沒有活性的酚氧化酶原（proPPO）形式，可以避免酪氨酸和酪氨酸殘基的氧化[10]。酶原大多分布于血細(xì)胞與大顆粒細(xì)胞中[13]，與模式識(shí)別蛋白（PRP）、絲氨酸蛋白酶（SP）等一同構(gòu)成復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)。目前，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的激活機(jī)制尚不明確[14]，推測(cè)是多酚氧化酶原激活系統(tǒng)（proPPO-AS）在血淋巴的小顆粒細(xì)胞（SGC）、顆粒細(xì)胞（GC）中合成、儲(chǔ)存和釋放。一些外源多糖，如肽聚糖、脂多糖等微生物細(xì)胞壁的成分可以與分子識(shí)別蛋白結(jié)合[4]，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)將無活性的proPPO轉(zhuǎn)化為有活性的PPO，詳見圖2[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在蝦死后的貯藏過程中，多酚氧化酶活性的變化可能與絲氨酸蛋白酶的遷移相關(guān)[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，某些微生物可能會(huì)激活對(duì)蝦死后的酚氧化酶原[16]，但具體機(jī)制尚不明確。

2.3血藍(lán)蛋白的多酚氧化酶活性

在甲殼類動(dòng)物中，多酚氧化酶不是唯一表現(xiàn)出酚氧化酶活性的蛋白質(zhì)，血藍(lán)蛋白（Hemocyanin，Hc）也具有一定的活性[17]。血藍(lán)蛋白作為含銅呼吸蛋白，主要存在于部分軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的血淋巴、血漿中，主要參與氧轉(zhuǎn)運(yùn)過程，兼具多功能免疫效應(yīng)[18]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Hc與PPO同屬于3型銅蛋白，具有相似的活性位點(diǎn)[18]，并且二者在物理化學(xué)性質(zhì)、氨基酸序列、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)等方面非常相似[19]（圖3），因此推測(cè)Hc也具有酚氧化酶活性[17]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白通過蛋白質(zhì)分解、空間構(gòu)象改變而暴露酶活性位點(diǎn)，產(chǎn)生PPO????????????????????????????????????????? 活性[20]。

3蝦黑變的抑制方法

3.1化學(xué)方法

3.1.1多酚氧化酶抑制劑的抑制類型多酚氧化酶抑制劑主要來源于天然植物及化學(xué)合成。根據(jù)其抑制機(jī)制分為可逆抑制與不可逆抑制，其中可逆抑制又可以細(xì)分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合型抑制和緩慢結(jié)合型抑制，具體見表1[21]。

3.1.2化學(xué)合成抑制劑二氧化硫類似物是一種方便有效、成本低廉的抑制劑，但是其殘留的SO2對(duì)人體的呼吸和消化系統(tǒng)具有一定危害。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織都嚴(yán)格規(guī)定，蝦肉中SO2殘留量不得超過0.1 mg/g[22]。由于二氧化硫類似物的使用受到了限制，近年來研究者致力于尋找更加可靠安全的防黑變劑。目前研究的二氧化硫類似物的替代品主要有單酚基化合物、巰基化合物等。

4-己基間苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可與多酚氧化酶雙銅活性中心結(jié)合而生成一種高穩(wěn)定性的絡(luò)合物，該產(chǎn)物通過消耗PPO來減少酶與底物的接觸，在較大程度上抑制黑變[22]。目前，4-己基間苯二酚類抑制劑在中國(guó)的使用較普遍，根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[23]的規(guī)定，4-己基間苯二酚類抑制劑在蝦中的最大用量為1 mg/kg。有學(xué)者認(rèn)為，4-HR雖然兼具抑菌和抑黑變能力，但在低濃度下的抑菌能力不強(qiáng)，主要表現(xiàn)為抑制黑變作用[24]。

抗壞血酸（L-ascorbic acid，AsA）通過與PPO活力中心絡(luò)合，直接抑制PPO活性及還原中間產(chǎn)物醛類產(chǎn)生[22]，屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，但是抗壞血酸對(duì)黑變現(xiàn)象的抑制效果有限，并且抗壞血酸自身的氧化也會(huì)產(chǎn)生黃褐色的色素，從而影響蝦的色澤。曲酸（Kojic acid，KA）可作為一種競(jìng)爭(zhēng)性抑黑變劑。研究發(fā)現(xiàn)，曲酸可與PPO結(jié)合并改變酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而降低酶活性[25]。在高濃度下，曲酸表現(xiàn)出更高的PPO抑制能力[3]，但同時(shí)也表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，能殺死游離活細(xì)胞[26]。

在其他化學(xué)防黑變劑中，熊果苷對(duì)中華管鞭蝦的黑變也具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[22]，但是其抑制效應(yīng)弱于O-羥基苯甲醛、m-羥基苯甲醛[27]。劉蒙娜等[28]通過篩選發(fā)現(xiàn)，L-胱氨酸、還原性谷胱甘肽和N-乙酰-L-半胱氨酸具有較好的抑制黑變效果，此外有研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈉也具有極好的抑制效果[29]。

3.1.3天然抑制劑近年來，隨著人們對(duì)食品安全問題關(guān)注度的提升，生物來源的天然抑制劑逐漸受到人們青睞。動(dòng)植物提取液中存在的天然多酚氧化酶抑制劑，具有抗氧化、抗菌活性，如云樹葉提取物、菲律賓蛤仔水提液、腰果葉提取物等，均可以作為天然抑制劑來有效地控制蝦黑變，延長(zhǎng)其貨架期。部分天然防黑變保鮮劑的用量與作用機(jī)制見表2。

茶葉中存在多種生物活性成分，具有一定的抗氧化活性，可在一定程度上抑制微生物生長(zhǎng)，如槲皮素、茶多酚、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）等。其中，2%茶多酚具有良好的抑菌性和PPO抑制性[37]。EGCG在幾種兒茶素中具有最高的PPO抑制活性[32]，常輔以超聲波使用[38]。槲皮素作為競(jìng)爭(zhēng)性抑黑變劑，其具有的兒茶酚結(jié)構(gòu)與酶活性位點(diǎn)螯合，使酶構(gòu)象發(fā)生變化[39]，能夠部分代替4-HR防黑變[40]。此外，同樣具有兒茶酚基團(tuán)的黃酮類化合物木犀草素也具有一定的抑黑變效果[41]。

殼聚糖是一種近年來在食品保鮮行業(yè)中具有較高使用價(jià)值的高分子聚合物。一般認(rèn)為，當(dāng)殼聚糖含量≥2%時(shí)，能夠起到較好的抑黑變效果[42]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在較低含量下，殼聚糖同樣能夠起到一定效果[37]，這可能與殼聚糖的結(jié)構(gòu)、來源與環(huán)境因素等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖與亞硫酸鹽制劑的組分之間存在協(xié)同作用[43]，殼聚糖具備較好的成膜性，與其他抑制劑（如香芹酚、石榴皮提取物、綠茶提取物等）聯(lián)用時(shí)，能夠更好地抑制PPO活性。

3.2物理方法

目前，物理方法已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外食品保鮮行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，主要通過降低氧氣濃度、低溫儲(chǔ)藏運(yùn)輸結(jié)合臭氧、紫外抑菌抑黑變等方式延長(zhǎng)食品的貨架期。在低溫條件下，蝦體內(nèi)的酶活性降低，微生物生長(zhǎng)緩慢，能夠有效地延緩蝦品質(zhì)的下降速度。真空包裝結(jié)合低溫常用于市售蝦仁的貯藏，通過低溫?zé)o氧條件降低酶活性，進(jìn)而抑制蝦體內(nèi)的酶促褐變反應(yīng)速度[4]。此外，真空包裝也常與殼聚糖涂膜及臭氧殺菌等方法共同使用。高密度二氧化碳（Dense phase carbon dioxide，DPCD）是一種具有較好殺菌效果的非熱殺菌技術(shù)，目前常應(yīng)用于食品殺菌、鈍酶等過程，能最大限度地保留食品的原有品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，DPCD能有效延長(zhǎng)凡納濱對(duì)蝦的冷藏貨架期[44]。此外，超臨界CO2處理可以更好地維持其感官特性[45]。另外，超高壓處理（Ultra-high pressure，UHP）可在一定條件下抑制蝦的褐變，有研究發(fā)現(xiàn)，UHP處理能夠鈍化酶活性，降低褐變程度[46]，若要使蝦中的PPO完全失活，則應(yīng)結(jié)合其他技術(shù)。

3.3其他方法

酸性電解水是一種環(huán)保的新型殺菌保鮮劑，由于其具有良好的抑菌性，目前作為一種混合性抑菌劑已經(jīng)被用于海產(chǎn)品保鮮方面。Sun等[47]研究發(fā)現(xiàn)，酸性電解水能夠顯著延緩南美白對(duì)蝦外觀黑變，從而保持其儲(chǔ)藏過程pH值的穩(wěn)定性，具有良好的殺菌效果和抑制黑變效果。

4展望

近年來，國(guó)內(nèi)關(guān)于蝦黑變過程及防黑變保鮮技術(shù)的研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)展，然而目前對(duì)黑變機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然不足。一方面，PPO作為活體蝦等甲殼類動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵一環(huán)，在其死后貯藏過程中如何受微生物影響而被激活的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。近年來，隨著生物信息學(xué)方法的發(fā)展，借助多組學(xué)技術(shù)，相關(guān)研究有望實(shí)現(xiàn)突破。另一方面，新型保鮮劑種類繁多，但是篩選有效的新型保鮮劑耗時(shí)耗力，而借助分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件可為保鮮劑抑制效果、抑制類型的研究提供幫助。此外，將多種保鮮劑和保鮮方法聯(lián)合使用，通過優(yōu)化組合，更好地利用其協(xié)同效應(yīng)或?qū)⒊蔀檠芯繜狳c(diǎn)。未來隨著多酚氧化酶作用機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，將促進(jìn)蝦防黑變保鮮及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：徐艷）