腺苷受體對大鼠丙泊酚復(fù)吸行為的影響及作用機(jī)制

董張雷 王欣 李軍 王本福 連慶泉 吳彬彬

[摘要] 目的 通過靜脈自身給藥方法建立大鼠丙泊酚復(fù)吸模型（環(huán)境線索誘導(dǎo)），探討腺苷受體在丙泊酚復(fù)吸行為中的作用機(jī)制，并探討其復(fù)吸機(jī)制。 方法 （1）清潔級雄性SD大鼠24只（14～16周），采用固定比率FR1程序訓(xùn)練大鼠形成穩(wěn)定的自身給藥模型，戒斷14 d后重返原來的訓(xùn)練籠進(jìn)行環(huán)境線索誘導(dǎo)的丙泊酚復(fù)吸行為測試，測試前15 min分別腹腔注射等量溶劑和腺苷A2AR拮抗劑KW6002（0.3、1.0、3.0 mg/kg），觀察其對大鼠丙泊酚復(fù)吸行為的影響，并檢測大鼠伏隔核內(nèi)D2R的表達(dá);（2）另取24只大鼠采用FR1程序進(jìn)行自身給予蔗糖顆粒訓(xùn)練成功后，同樣戒斷14 d后進(jìn)行蔗糖復(fù)吸行為測試，在測試前15 min同樣腹腔注射等量溶劑和KW6002（0.3、1.0、3.0 mg/kg），觀察其對大鼠蔗糖復(fù)吸行為的影響;（3）準(zhǔn)備24只自發(fā)活動測試箱，分別放入24只雄性SD大鼠，適應(yīng)環(huán)境1 h后，腹腔注射腺苷A2AR拮抗劑KW6002（0.3、1.0、3.0 mg/kg）和等量溶劑作為對照，15 min后放回箱底，測試并記錄大鼠3 h內(nèi)的自發(fā)活動度。 結(jié)果 與對照組相比，腺苷A2AR拮抗劑KW6002可以劑量依賴性地增強(qiáng)環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸行為（P<0.01），并增加伏隔核區(qū)D2R表達(dá)（P<0.01）。與對照組相比，KW6002對大鼠蔗糖覓藥行為及自發(fā)活動度均無影響（P>0.05）。 結(jié)論 腺苷受體參與調(diào)節(jié)大鼠丙泊酚復(fù)吸行為，可能是通過調(diào)節(jié)伏隔核區(qū)多巴胺受體實現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 丙泊酚;復(fù)吸;腺苷;自身給藥

[中圖分類號] R964? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）32-0035-05

[Abstract] Objective By establishing a rat propofol relapse model（induced by environmental cues） through intravenous self-administration， to explore the mechanism of action of adenosine receptors in propofol relapse behavior and its relapse mechanism. Methods （1）24 clean-grade male SD rats（14-16 weeks）. The rats were trained to form a stable self-administration model using a fixed ratio FR1 program. After 14 days of withdrawal， they were reintroduced to training-chambers for propofol relapse testing induced by environmental cues. 15 minutes before the test， the same amount of solvent and adenosine A2AR antagonist KW6002（0.3， 1.0， 3.0 mg/kg） were injected into the abdominal cavity respectively， and its effect on propofol relapse behavior of rats was observed， and the expression of D2R in the rat nucleus accumbens was tested; （2）Another 24 rats were successfully trained with self-administration of sucrose pellets by using the FR1 program. After 14 days of withdrawal， they were also given a sucrose relapse behavior test. 15 minutes before the test， the same amount of solvent and KW6002（0.3， 1.0， 3.0 mg/kg） were injected intraperitoneally） to observe its effect on the relapse behavior of sucrose in rats; （3）Prepare 24 spontaneous activity test boxes and put 24 male SD rats into them. After adapting to the environment for 1 hour， intraperitoneally inject adenosine A2AR antagonist KW6002（0.3， 1.0， 3.0 mg/kg） and the same amount of solvent as a control for 15 minutes. Then put it back to the bottom of the box， test and record the rat's spontaneous activity within 3 h. Results Compared with the control group， the adenosine A2AR antagonist KW6002 can enhance the propofol relapse behavior induced by environmental cues in a dose-dependent manner（P<0.01） and increase the expression of D2R in the nucleus accumbens（P<0.01）. Compared with the control group， KW6002 had no effect on the sucrose drug-seeking behavior and spontaneous activity of rats（P>0.05）. Conclusion Adenosine receptors are involved in the regulation of propofol relapse behavior in rats， which may be achieved by regulating dopamine receptors in the nucleus accumbens.

[Key words] Propofol; Relapse; Adenosine; Self-administration

環(huán)境線索誘發(fā)的藥物渴望和復(fù)發(fā)行為是藥物濫用的主要特征之一，是非常有挑戰(zhàn)性的臨床問題，也是成癮藥物戒斷的主要障礙。研究表明，丙泊酚具有成癮性，且停藥后使用者有再次用藥的渴求[1-2]。動物實驗同樣證明，丙泊酚停藥后具有復(fù)吸特性[3]。但目前丙泊酚的復(fù)吸機(jī)制仍未明確，深入研究機(jī)制對丙泊酚濫用患者的治療和戒斷具有指導(dǎo)意義。伏隔核（NAc）多巴胺系統(tǒng)是中腦邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與眾多藥物成癮過程。研究發(fā)現(xiàn)，腺苷通過腺苷受體可以調(diào)控多種神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、谷氨酸和GABA等，在藥物的成癮過程中發(fā)揮作用[4-5]。故本研究采用靜脈自身給藥方式，建立大鼠丙泊酚復(fù)吸模型（環(huán)境線索誘導(dǎo)），腹腔注射腺苷A2AR，并檢測伏隔核內(nèi)D2R的表達(dá)，探討腺苷受體介導(dǎo)丙泊酚復(fù)吸行為的生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 動物與方法

1.1 實驗動物

72只雄性SD大鼠，周齡14～16周，體重250～280 g。購買于上海斯萊克實驗動物中心。分籠飼養(yǎng)于清潔級動物房內(nèi)，24 h晝夜節(jié)律（9am～9pm），每日食物控制在20 g左右，自由進(jìn)水。環(huán)境溫度控制在22～24℃，相對濕度為50%～70%。動物許可證號：SYXK（浙）2010-0150。通過溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》原則（國家科技部2006年頒發(fā)）。

1.2 試劑及配置

KW6002（美國sigma）溶于10%DMSO+90%ddH2O。丙泊酚（意大利阿斯利康公司，批號NK317），大鼠自發(fā)反應(yīng)操作籠（購于寧波生物科技研究所），電子天平（購于德國賽多利斯），Western blot電泳儀（購于Bio-Rad）。

1.3 大鼠丙泊酚復(fù)吸模型建立

大鼠頸外靜脈插管恢復(fù)7 d后開始自身給藥訓(xùn)練，訓(xùn)練方式如以往研究[2]。用FR1程序，每天訓(xùn)練3 h。大鼠碰觸1次有效鼻觸得到1次1.7 mg/kg的丙泊酚注射，給藥結(jié)束后進(jìn)入30 s不應(yīng)期：此時大鼠碰觸有效鼻觸無丙泊酚注射。不應(yīng)期結(jié)束后進(jìn)入下一個循環(huán)，大鼠碰觸無效鼻觸時無丙泊酚注射，僅記錄鼻觸反應(yīng)次數(shù)。約14 d建立穩(wěn)定的自身給藥模型，然后進(jìn)入戒斷期。戒斷期間大鼠自由飲水，每日控制飲食30 g。戒斷期（14 d）結(jié)束后，大鼠重新返回原來的訓(xùn)練籠進(jìn)行復(fù)吸行為測試。大鼠丙泊酚復(fù)吸訓(xùn)練開始前15 min，分別給予等量溶劑或KW6002，復(fù)吸訓(xùn)練期間大鼠碰觸有效鼻觸1次可獲得1次條件性刺激（即有效鼻觸探頭內(nèi)小黃燈亮，同時伴隨注射泵轉(zhuǎn)動聲音），但無丙泊酚注射。有效鼻觸次數(shù)明顯高于無效鼻觸次數(shù)，表明環(huán)境線索誘導(dǎo)的丙泊酚復(fù)吸模型建立成功。

1.4 大鼠蔗糖復(fù)吸實驗

將24只準(zhǔn)備好的大鼠隨機(jī)放入實驗訓(xùn)練籠內(nèi)，同樣采用FR1程序，每日訓(xùn)練30 min，連續(xù)7 d。同樣在大鼠蔗糖覓食行為穩(wěn)定后戒斷14 d，在第15天訓(xùn)練開始前15 min，將大鼠隨機(jī)分為四組（n=6），分別腹腔注射等量溶劑或KW6002（0.1、0.3、1.0 mg/kg），記錄KW6002對大鼠自身給予蔗糖復(fù)吸行為的影響。

1.5 Western-blot檢測

大鼠丙泊酚復(fù)吸行為測試結(jié)束后立即將大鼠處死，將分離出的腦組織放入勻漿器內(nèi)，加入蛋白酶抑制劑和裂解液，充分搗碎。將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，超聲破碎，離心機(jī)離心。制膠，上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，Western封閉液室溫封閉2 h。加用一抗，4℃搖床過夜，二抗常溫孵育2 h。內(nèi)參物為GAPDH。最后暗室曝光，Image J 2.0軟件分析結(jié)果。

1.6 自發(fā)活動檢測

分別將24只大鼠隨機(jī)放入檢測箱中，適應(yīng)環(huán)境1 h后，腹腔注射KW6002（0.1、0.3、1.0 mg/kg）或等量對照溶劑，15 min后將大鼠重新放回測試箱，計算機(jī)自動測試并記錄大鼠3 h內(nèi)的自發(fā)活動度。

1.7 觀察指標(biāo)

（1）大鼠丙泊酚戒斷14 d后，與自身給藥時比較，有效鼻觸次數(shù)、無效鼻觸次數(shù)變化，判斷復(fù)吸模型是否建立，KW6002給藥后大鼠有效鼻觸、無效鼻觸次數(shù)變化及NAc區(qū)D2R的表達(dá)水平。（2）大鼠蔗糖覓藥行為戒斷14 d后，有效鼻觸次數(shù)、無效鼻觸次數(shù)變化，KW6002給藥后對有效鼻觸、無效鼻觸次數(shù)的改變。（3）大鼠自發(fā)活動度檢測：大鼠3 h內(nèi)的水平活動距離。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，Graphpad 8.0軟件作圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，腹腔注射給藥后各組大鼠行為學(xué)對比及Western blot檢測結(jié)果采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Levene法檢驗方差齊性，兩兩比較采用LSD方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠丙泊酚復(fù)吸模型建立

隨著訓(xùn)練時間延長，大鼠的有效鼻觸次數(shù)逐漸增加，并趨于穩(wěn)定，而無效鼻觸次數(shù)一直無增加，且明顯低于有效鼻觸次數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明大鼠丙泊酚依賴模型建立。戒斷14 d后，與丙泊酚自身給藥組相比，復(fù)吸組大鼠的丙泊酚有效鼻觸次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而無效鼻觸次數(shù)無明顯改變（P>0.05），環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸模型建立。見表1～2。

2.2 大鼠蔗糖復(fù)吸行為模型建立

大鼠蔗糖行為訓(xùn)練7 d左右，蔗糖顆粒攝入次數(shù)保持在100次左右水平，模型成功建立。戒斷14 d后，檢測大鼠蔗糖復(fù)吸行為即有效鼻觸次數(shù)保持在較高水平。與蔗糖自身給藥組相比，大鼠有效鼻觸次數(shù)和無效鼻觸次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3 腹腔注射KW6002對環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸行為的影響

大鼠復(fù)吸行為測試前15 min分別腹腔注射對照溶劑或A2AR拮抗劑KW6002（0.3、1.0、3.0 mg/kg），觀察其對大鼠丙泊酚復(fù)吸行為的影響。與對照組相比，各組大鼠2 h內(nèi)的有效鼻觸次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而無效鼻觸次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.4 Western blot法檢測腹腔注射KW6002對NAc內(nèi)多巴胺D2R表達(dá)水平的影響

大鼠丙泊酚復(fù)吸行為測試結(jié)束后，立即將其處死，Western blot法檢測四組大鼠NAc內(nèi)D2R蛋白表達(dá)的變化。與溶劑組比，腹腔注射KW6002（1.0、3.0 mg/kg）后，NAc內(nèi)多巴胺D2R蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表5、圖1。

2.5 腹腔注射KW6002對環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠自身給予蔗糖復(fù)吸行為的影響

大鼠蔗糖復(fù)吸開始前15 min，分別腹腔注射對照溶劑和不同劑量KW6002（0.1、0.3、1.0 mg/kg），與溶劑組比，大鼠蔗糖顆粒攝入數(shù)、無效鼻觸數(shù)、有效鼻觸數(shù)未見明顯改變（P>0.05）。見表6。

2.6 腹腔注射KW6002對大鼠活動度的影響

實驗前15 min分別腹腔注射給予KW6002（0.1、0.3、1.0 mg/kg）或?qū)φ杖軇?。觀察KW6002給藥對大鼠自發(fā)活動度的影響。與對照組相比，KW6002不同劑量組對自發(fā)活動度沒有影響（P>0.05）。見表7。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射腺苷A2AR拮抗劑KW6002可增強(qiáng)環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸行為，且明顯增加大鼠NAc區(qū)多巴胺D2R表達(dá)，而同劑量的KW6002對大鼠自發(fā)活動度和蔗糖復(fù)吸行為無明顯影響。因此，推測腺苷受體參與介導(dǎo)大鼠丙泊酚復(fù)吸行為。

腺苷作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，根據(jù)與腺苷的親和力不同，分為4個不同的亞型，分別是A1、A2A、A2B和A3受體，在睡眠調(diào)節(jié)、帕金森病治療、藥物成癮機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，長期使用嗎啡增加大鼠對NAc區(qū)的腺苷敏感性，其機(jī)制可能是通過抑制腺苷重吸收，通過負(fù)反饋作用刺激腺苷釋放。而且長期使用嗎啡引起紋狀體內(nèi)腺苷轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增加[7-8]。大鼠NAc區(qū)的腺苷代謝物水平在阿片類藥物戒斷期間增加[9]。大鼠腹腔或NAc注射腺苷A2AR阻滯劑DMPX抑制海洛因的攝入[10]。阿片類依賴小鼠敲除A2AR后加重戒斷癥狀[11]。本研究通過腹腔注射KW6002證明其參與大鼠丙泊酚復(fù)吸行為，且對大鼠蔗糖復(fù)吸行為沒有影響，說明其具有特異性。

腺苷主要通過腺苷受體影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）等的釋放，在藥物成癮過程中起調(diào)節(jié)作用。已知伏隔核多巴胺系統(tǒng)在藥物成癮過程中發(fā)揮重要作用。而伏隔核主要通過中型棘突GABA能神經(jīng)元的直接通路和間接通路興奮多巴胺受體。其中A2AR大量分布在腦部紋狀體區(qū)域，該區(qū)域主要參與情緒、學(xué)習(xí)的調(diào)節(jié)。研究表明，腺苷A2AR可與A1R、D2R、CB1R和mGlu5形成共聚體而相互作用[12-13]。其中以A2AR-D2R共聚體與藥物成癮關(guān)系最密切。A2AR-D2R在紋狀體蒼白球間接通路上形成異二聚體，兩者在分子、神經(jīng)化學(xué)和行為學(xué)水平上相互拮抗[14-15]。激活NAc內(nèi)D2R可以通過間接降低GABA。而興奮A2AR可以恢復(fù)D2R引起的腹側(cè)蒼白球內(nèi)的GABA下降。同時A2AR活化可以刺激腺苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而激活cAMP-PKA信號通路[16];通過激活D2R可以偶聯(lián)Gi/o蛋白，從而抑制A2AR介導(dǎo)的cAMP-PKA信號通路[17]。同時，激活A(yù)2AR可減弱D2R與多巴胺的結(jié)合，進(jìn)而影響神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺受體、GABA系統(tǒng)均參與大鼠丙泊酚的成癮過程[2，19-20]。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射KW6002大鼠伏隔核區(qū)多巴胺D2R表達(dá)增加，從而引起大鼠復(fù)吸行為增強(qiáng)。這也符合前期研究結(jié)果：腹腔注射D2R減弱環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸行為[21]。根據(jù)A2AR-D2R之間相互拮抗的原理，推測阻斷A2AR可能激活了D2R介導(dǎo)的信號通路。且本研究結(jié)果與前人的研究也一致：腹腔或者NAc內(nèi)注射腺苷A2AR激動劑CGS21680可減弱大鼠藥物環(huán)境線索誘導(dǎo)的復(fù)吸行為[22-23]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射KW6002可以增加環(huán)境線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚復(fù)吸行為及腦區(qū)D2R表達(dá)增加，說明腺苷受體參與介導(dǎo)大鼠丙泊酚復(fù)吸行為，可能是通過影響伏隔核內(nèi)多巴胺受體水平起作用。

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（收稿日期：2020-07-20）