基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物監(jiān)管現(xiàn)狀及其面臨的育種領(lǐng)域的挑戰(zhàn)

黃春蒙, 朱鵬宇, 王智, 王晨光, 杜智欣, 魏霜, 張永江, 付偉*

1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京100176；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京100193；

3.南寧海關(guān)技術(shù)中心, 南寧 530029；

4.廣州海關(guān)技術(shù)中心, 廣州 510623

在全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的第23個(gè)年頭，全球轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用(用作糧食、飼料和加工用途的耕種和進(jìn)口)的增長(zhǎng)可以證明轉(zhuǎn)基因作物不僅在農(nóng)業(yè)、社會(huì)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境方面均產(chǎn)生了良好收益，而且提高了食品安全水平、改善了營(yíng)養(yǎng)水平[1]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)作為常用于植物育種領(lǐng)域的技術(shù)，以其高效特異、可以同時(shí)沉默多個(gè)靶基因、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)為農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支撐。各個(gè)國(guó)家或地區(qū)對(duì)于RNAi轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管評(píng)價(jià)均是在原有的轉(zhuǎn)基因植物監(jiān)管框架上進(jìn)行的，但是由于RNAi轉(zhuǎn)基因植物的分子特征等信息與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物存在一定的差異，因此，構(gòu)建適用于RNAi轉(zhuǎn)基因植物的安全評(píng)價(jià)指標(biāo)和監(jiān)管體系顯得尤為必要。與此同時(shí)，由于RNAi的作用機(jī)制并未完全明確，因此將RNAi技術(shù)應(yīng)用于改良育種還有相應(yīng)的問(wèn)題亟待解決。本文從轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管現(xiàn)狀出發(fā)，闡述了轉(zhuǎn)基因植物主要種植國(guó)家或地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管政策，以便我國(guó)政府和相關(guān)科研人員完善RNAi轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)體系和相關(guān)政策，同時(shí)，提出了RNAi技術(shù)應(yīng)用于改良育種過(guò)程中可能面臨的問(wèn)題和原因，并在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上提出可能的解決方法，以期助力RNAi技術(shù)的應(yīng)用推廣。

1 RNAi轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管現(xiàn)狀

隨著新型育種技術(shù)的發(fā)展，一些基于RNAi技術(shù)的新產(chǎn)品已經(jīng)問(wèn)世。在此之前，不同國(guó)家或地區(qū)的法規(guī)對(duì)“基因修飾”概念存在較大差異，因而擁有不同的監(jiān)管思路和評(píng)價(jià)體系。目前，國(guó)際上對(duì)基因修飾生物(genetically modified organism，GMO)的監(jiān)管模式主要分為2大類[2]：一類是過(guò)程監(jiān)管，以歐盟為代表的過(guò)程監(jiān)管模式，他們認(rèn)為重組DNA技術(shù)本身具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此，只要是通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得的生物技術(shù)產(chǎn)品，均需接受安全性評(píng)價(jià)與監(jiān)控；另一類是以美國(guó)為代表的產(chǎn)品監(jiān)管模式，他們認(rèn)為本質(zhì)上，轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物沒(méi)有區(qū)別，監(jiān)控管理的對(duì)象是基因修飾產(chǎn)品，而并非生物技術(shù)本身?？傮w而言，過(guò)程監(jiān)管模式更為嚴(yán)格[3]。

辛普勞(J. R. Simplot)公司于2013年10月份針對(duì)其開(kāi)發(fā)的基于RNAi技術(shù)的W8馬鈴薯在美國(guó)提出商業(yè)化申請(qǐng)。這是全球范圍內(nèi)提出商業(yè)化批準(zhǔn)的首例基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因品系。申報(bào)文件顯示，該公司對(duì)W8進(jìn)行了細(xì)致的環(huán)境安全、生態(tài)安全、食用安全以及分子特征信息的評(píng)價(jià)，采用的安全評(píng)價(jià)流程與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物基本一致。美國(guó)通過(guò)研發(fā)人員和政府主管部門(mén)之間相互咨詢協(xié)作的方法，以個(gè)案分析為原則，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture，USDA)、食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)及環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency，EPA)3個(gè)機(jī)構(gòu)聯(lián)合監(jiān)管RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。其中，USDA負(fù)責(zé)審查是否存在潛在的植物有害化風(fēng)險(xiǎn)，如果RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不包含使植物有害化序列，則是否應(yīng)用了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等均不受USDA監(jiān)管；FDA的立場(chǎng)是基于咨詢，具有市場(chǎng)化監(jiān)管職能；EPA對(duì)賦予植物殺蟲(chóng)活性或抗病性的RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品基于個(gè)案進(jìn)行評(píng)估，如RNAi干擾棉酚合成的棉花TAM66274[4]和RNAi干擾木質(zhì)素合成的苜蓿KK179[5]。但美國(guó)FDA和EPA對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管尚未給出正式意見(jiàn)。對(duì)待轉(zhuǎn)基因作物態(tài)度最為謹(jǐn)慎的國(guó)家或地區(qū)之一就是歐盟，其標(biāo)識(shí)閾值為0.9%。歐盟對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度從其轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)制度和作物批準(zhǔn)流程中都能得到體現(xiàn)[6-7]。目前，對(duì)于已經(jīng)在美國(guó)獲批的基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯W8品系以及轉(zhuǎn)基因玉米MON87411品系，歐盟仍在審批過(guò)程中?？傊?，歐盟對(duì)于RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品保留著一貫嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。

《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》是我國(guó)轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)和相關(guān)監(jiān)管工作的指導(dǎo)性文件。我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了干擾木質(zhì)素合成的RNAi轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179的應(yīng)用。此外，也有RNAi轉(zhuǎn)基因植物提交了安全證書(shū)的申請(qǐng)，具有高油酸(gm-fad-2)性狀的RNAi轉(zhuǎn)基因大豆DP305423和高油酸(gm-fad-2)、除草劑抗性(cp4-epsps)復(fù)合性狀的RNAi轉(zhuǎn)基因大豆作為加工原料的生物安全證書(shū)正在審批中。目前我國(guó)按照《轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)指南》進(jìn)行RNAi轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)，但實(shí)際適用的RNAi轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容和指標(biāo)還需要進(jìn)一步細(xì)化和完善。

2 RNAi轉(zhuǎn)基因植物育種面臨的挑戰(zhàn)

2.1 脫靶效應(yīng)

最初，基因沉默RNAi機(jī)制被認(rèn)為是小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)與同源靶mRNA序列特異性識(shí)別從而引發(fā)切割降解的機(jī)制。然而有證據(jù)表明，siRNA并不總是靶向特定基因，當(dāng)siRNA靶向非靶基因的mRNA時(shí)就會(huì)導(dǎo)致非特異性基因沉默[8-9]，這種現(xiàn)象被稱為脫靶(off-target)。植物擬南芥和煙草在轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)中可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)已有報(bào)道[9]。脫靶可能是RNAi轉(zhuǎn)基因植物潛在的生物安全性問(wèn)題。從RNAi的發(fā)生機(jī)制和作用過(guò)程等方面分析脫靶發(fā)生的原因，可以總結(jié)為9個(gè)方面：①長(zhǎng)的發(fā)夾RNA，即雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，可以產(chǎn)生多樣化的siRNA文庫(kù)以發(fā)揮最優(yōu)的沉默效應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)提高脫靶的可能性；②dsRNA的數(shù)量高于所需要的閾值越多，脫靶效應(yīng)發(fā)生的可能性就越大；③由RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)介導(dǎo)的小RNA(small RNA，sRNA)或部分dsRNA的擴(kuò)增可能產(chǎn)生次級(jí)dsRNA[10]，這對(duì)細(xì)胞內(nèi)dsRNA的數(shù)量具有較大的影響；④在RNAi技術(shù)中需要使用強(qiáng)大的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)發(fā)夾RNA(hairpin RNA，hpRNA)的產(chǎn)生，由于抑制了天然微小RNA(microRNA，miRNA)或siRNA的調(diào)節(jié)，可能有利于一種完全不同類型的脫靶效應(yīng)；⑤觸發(fā)序列，即與mRNA互補(bǔ)同源的觸發(fā)序列，可能發(fā)生變化；⑥研究發(fā)現(xiàn)，21 nt沉默觸發(fā)序列與內(nèi)源性靶基因序列之間100%同源性的核苷酸延伸并不是引發(fā)基因沉默的絕對(duì)必要條件[9,11]；⑦通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和計(jì)算發(fā)現(xiàn)3′端非翻譯區(qū)的匹配更易引起非預(yù)期沉默[12]；⑧與動(dòng)物[13]相比，植物可以容忍少量的錯(cuò)配，從而增加了脫靶的可能性；⑨siRNA是沉默特異性的最終決定因素。發(fā)生脫靶效應(yīng)的途徑和原因眾多[14]，為了減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生，本文提出了以下5點(diǎn)建議：①將siRNA文庫(kù)在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，并利用生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測(cè)發(fā)生脫靶的可能性；②選擇具有組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的RNAi載體；③保持有效siRNA的最低數(shù)量；④驗(yàn)證靶基因沉默的特異性；⑤謹(jǐn)慎解釋RNAi基因功能沉默和表型研究的結(jié)果。

2.2 RNAi沉默效率

影響RNAi效率的因素較多，最主要的因素不僅與siRNA自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與siRNA發(fā)揮作用的過(guò)程有關(guān)。首先，植物組織中dsRNA濃度對(duì)于發(fā)揮RNAi效應(yīng)至關(guān)重要，必須有足夠的dsRNA來(lái)觸發(fā)足夠強(qiáng)的RNAi反應(yīng)。然而，在低濃度下，沉默效應(yīng)的強(qiáng)度明顯依賴于劑量，目前還無(wú)法預(yù)測(cè)dsRNA的最優(yōu)濃度，因此需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。其次，植物產(chǎn)生的dsRNA片段的序列和長(zhǎng)度也對(duì)RNAi效率具有一定的影響。如在果蠅細(xì)胞中，dsRNA有效誘導(dǎo)RNAi的最小長(zhǎng)度要求為21 bp[15]。再者，dsRNA或者siRNA的穩(wěn)定性對(duì)RNAi的反應(yīng)具有較大影響，dsRNA在發(fā)揮作用前降解必然導(dǎo)致沉默失效。此外，靶標(biāo)選擇具有物種特異性，一個(gè)合適的靶標(biāo)mRNA在另一個(gè)物種中未必是最合適的靶標(biāo)。如對(duì)于RNAi抗蟲(chóng)作物來(lái)說(shuō)，影響昆蟲(chóng)RNA干擾效率的因素與細(xì)胞攝取dsRNA的能力有關(guān)。dsRNA的主要接觸途徑是口服，dsRNA必須進(jìn)入靶標(biāo)昆蟲(chóng)的細(xì)胞，使dsRNA與RNAi途徑關(guān)聯(lián)，從而產(chǎn)生下游效應(yīng)[16]。提高RNAi沉默效率的方法，除了深入了解各物種不同靶標(biāo)的最適dsRNA設(shè)計(jì)，還要預(yù)測(cè)靶標(biāo)合適靶點(diǎn)和脫靶的可能性，優(yōu)化dsRNA轉(zhuǎn)化途徑和方法，必要時(shí)可以考慮同時(shí)沉默家族基因多個(gè)靶標(biāo)以提高沉默效率。

2.3 抗性問(wèn)題

RNAi轉(zhuǎn)基因植物的抗性問(wèn)題主要集中于有害生物抗性，如抗病毒、抗蟲(chóng)等。轉(zhuǎn)基因作物被靶標(biāo)害蟲(chóng)長(zhǎng)期食用后，在作物的相應(yīng)靶標(biāo)生物種群中可能產(chǎn)生抗性從而導(dǎo)致作物抗蟲(chóng)的持久性降低[17-19]。理論上應(yīng)考慮3個(gè)可能產(chǎn)生抗性的因素。首先，突變使昆蟲(chóng)的RNAi機(jī)制失活(或使其效率低下)，從而導(dǎo)致外源擴(kuò)增的dsRNA無(wú)效[20]。然而，考慮到RNAi機(jī)制在昆蟲(chóng)發(fā)育和生理中所具有的基本功能(因?yàn)樗赗NA代謝和sRNA生成過(guò)程中起著多種重要作用)，使RNAi機(jī)制失活的突變很可能與昆蟲(chóng)的適應(yīng)能力和生存能力不兼容。RNAi機(jī)制中高度保守的缺失突變似乎不是害蟲(chóng)對(duì)環(huán)境RNAi的抗藥性來(lái)源。其次，抗性可能是由于靶基因序列中突變的積累而引起的。從理論上講，足夠數(shù)量的點(diǎn)突變(或少量缺失)可將靶基因與dsRNA之間的同源性降低到由dsRNA生成的siRNA不再有效識(shí)別靶基因mRNA的程度。然而，鑒于在植物中表達(dá)的dsRNA的長(zhǎng)度普遍有幾百個(gè)堿基甚至更長(zhǎng)，所以不太可能在合理的時(shí)間范圍內(nèi)積累足夠多的突變使靶基因mRNA不受影響，同時(shí)序列的激烈變化仍能夠與基因功能相兼容。一般情況下，一個(gè)必需基因被靶向，即使某個(gè)靶標(biāo)基因積累了多個(gè)突變而對(duì)植物產(chǎn)生的dsRNA不再敏感，仍然可以利用不同的必需基因來(lái)解決由單一必需基因突變累積產(chǎn)生的抗性問(wèn)題?？紤]到昆蟲(chóng)基因組上存在大量必需基因，即使并非所有必需基因都適合作為RNAi的靶點(diǎn)，這些大量的必需基因也不會(huì)成為限制。此外，阻礙基因突變以助力抗性發(fā)展的簡(jiǎn)單策略就是同時(shí)靶向多個(gè)必需基因，即在相同的植物中表達(dá)2個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因dsRNA，或者產(chǎn)生1個(gè)長(zhǎng)的嵌合dsRNA，包括2個(gè)或者更多靶基因序列[21]。最后，昆蟲(chóng)可能會(huì)對(duì)RNAi產(chǎn)生抵抗力，因?yàn)檫@些突變會(huì)影響消化道攝入dsRNAs的穩(wěn)定性和/或腸道細(xì)胞的吸收能力[22]。RNAi在不同的昆蟲(chóng)種類中效率差別較大，雖然很多機(jī)制不明確，但是也可能是抗性進(jìn)化的來(lái)源之一[23]。

2.4 跨界調(diào)控

siRNA分子在生物體中的遷移是一種普遍的現(xiàn)象，它促進(jìn)了細(xì)胞和組織之間的基因沉默。siRNA信號(hào)也在同一物種不同種類的生物體之間傳輸。這些生物可能發(fā)生在同一物種中，如母乳喂養(yǎng)嬰兒發(fā)生RNA介導(dǎo)的基因調(diào)控[24]；或者發(fā)生在不同物種之間，如寄生生物和寄主植物[25]。動(dòng)物和植物交換siRNA也被發(fā)現(xiàn)與致病性、寄生性或共生生物體密切相關(guān)[26]。此外，RNA沉默信號(hào)的跨界運(yùn)動(dòng)還有從細(xì)菌到線蟲(chóng)，從植物到病原和共生微生物，從植物到線蟲(chóng)，從真菌病原體到植物，從植物到昆蟲(chóng)等[27]。這些跨物種調(diào)控的現(xiàn)象有時(shí)對(duì)于生物體疾病抗性方面發(fā)揮積極作用，但是跨物種調(diào)控如果發(fā)生在人體，并發(fā)揮負(fù)面調(diào)控作用，將會(huì)給人類和其他生物帶來(lái)麻煩。Zhang等[28]在中國(guó)人的血液中檢測(cè)到了植物來(lái)源并調(diào)控人類基因的miRNA。因此，dsRNA或者siRNA的跨物種調(diào)控可能是RNAi應(yīng)用于植物生物技術(shù)育種的一個(gè)潛在生物安全性問(wèn)題，關(guān)系著人類的食品安全、身體健康和其他物種的生態(tài)平衡。但是這些跨界沉默現(xiàn)象的許多方面仍需深入研究，包括如何選擇特定的siRNAs進(jìn)行傳輸，siRNAs如何在細(xì)胞外運(yùn)輸、識(shí)別并進(jìn)入其目標(biāo)細(xì)胞，以及這些siRNAs如何使用目標(biāo)細(xì)胞的RNAi機(jī)制來(lái)傳遞沉默效應(yīng)的模式。

3 展望

2001年，RNAi技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因功能研究[29]，開(kāi)創(chuàng)了高等生物基因功能研究的先河，隨后被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域。RNAi技術(shù)應(yīng)用于植物育種改良領(lǐng)域得到了較好的成果，但其應(yīng)用潛力有待于進(jìn)一步挖掘。由于目前尚未完全明確RNAi的作用機(jī)制，尤其是在植物中的作用過(guò)程和參與相應(yīng)過(guò)程的蛋白，使得目前應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行植物育種仍然面臨一些挑戰(zhàn)[30]。未來(lái)基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物改良育種應(yīng)注重減少脫靶效應(yīng)、提高沉默效率、防止抗性產(chǎn)生，并進(jìn)一步明確sRNA的跨界調(diào)控機(jī)理。除此之外，為了守護(hù)國(guó)門(mén)生物安全，更好地利用生物技術(shù)產(chǎn)品并推動(dòng)農(nóng)業(yè)育種和基礎(chǔ)研究的發(fā)展，針對(duì)目前RNAi的研究現(xiàn)狀，應(yīng)加快建立科學(xué)全面的安全評(píng)價(jià)體系，完善基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管政策，規(guī)范RNAi育種作物的上市前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)市場(chǎng)應(yīng)用RNAi產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)，最大程度地發(fā)揮RNAi技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用，造福社會(huì)。