桂東九頭獅子草紅色素的純化及其穩(wěn)定性研究

梁冬梅，伍淑婕，湯 泉

（1.賀州學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

九頭獅子草［Peristrophe japonica (Thunb.) Bremek.］，為爵床科觀音草屬植物，又名紅藍草等，主要分布在我國貴州、廣西、廣東等地[1]，尤其在廣西桂東地區(qū)資源更為豐富。研究表明，九頭獅子草含有多種活性成分，如黃酮類化合物、生物堿、有機酸及微量元素等[2]，具有降酶保肝作用[3]、降壓作用[4-5]等，還是一種較穩(wěn)定安全的藥食兼用的天然色素源[6]。

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，相關(guān)行業(yè)對天然色素產(chǎn)量和品種的要求逐漸增加，作為食品添加劑來開發(fā)的天然食用色素替代合成色素，已成為熱點研究課題[7-9]。本課題以桂東生長的九頭獅子草為原料，進行紅色素提取，利用大孔樹脂進行純化，并研究其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種植于賀州學(xué)院東校區(qū)九頭獅子草基地的新鮮九頭獅子草，洗凈，晾干，備用。

大孔樹脂 (D-101、NKA-9、AB-8、S-8)、無水乙醇、蔗糖、葡萄糖、維C、氯化鈉、檸檬酸、碳酸氫鈉，氯化鉀、硫酸鎂、三氯化鋁等（均為分析純）。

1.2 主要儀器及設(shè)備

HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水真空泵，RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計，SP-722分光光度計，層析柱 (30cm×50 cm，30cm×70 cm)。

1.3 實驗方法

1.3.1 可見光范圍最大吸收波長的確定

1）大孔樹脂的預(yù)處理：按參考文獻[10]描述的方法，大孔樹脂先用無水乙醇浸泡24h，再用去離子水洗至無乙醇味，過濾，常溫下保存，備用。

2）色素粗液的制備：取新鮮九頭獅子草全株剪碎，稱取20g放入三角燒瓶中，加入蒸餾水250mL，在100℃沸水中提取2h，提取2次。合并提取液，過濾，濃縮至干，獲得色素粗品。

3）可見光范圍最大吸收波長的測定：對九頭獅子草紅色素溶液進行紫外光譜掃描，確定其在可見光范圍的最大吸收波長。

4）分析計算公式：

其中：A為吸光度值；V為體積，mL；Y為收率，%；m為質(zhì)量，g。

1.3.2 純化條件的研究

1）靜態(tài)吸附用大孔樹脂：分別取預(yù)處理過的樹脂各5.00g，加入吸光度為A0的粗色素溶液25 mL，25℃下浸泡24 h。測定上清液的吸光度，計算吸附率。

2）靜態(tài)吸附的動力學(xué)特征研究：準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的大孔樹脂5.00 g，裝入100 mL具塞磨口錐形瓶中，加入吸光度為A0的色素粗提液25 mL，25℃下恒溫震蕩，每20 min取上清液測定吸光度，直到達到平衡為止。做吸附率-時間曲線。

3）最大吸附量的確定：稱取預(yù)處理過的大孔樹脂5.00 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入吸光度為A0的九頭獅子草提取液 25、50、75、100 mL，25℃震蕩吸附12h，測定吸光度，并計算總吸附率?？偽铰始礊樽畲笪搅?。

4）靜態(tài)解吸考察不同乙醇濃度下的解吸率：取適量已吸附九頭獅子草紅色素的樹脂11組，分別加入10倍體積、不同體積分數(shù)的乙醇水溶液（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），震蕩12h后過濾，取濾液測定最大吸收波長處的吸光度。

5）動態(tài)等度洗脫：取適量活化的樹脂裝柱（30cm×50cm），將九頭獅子草紅色素原液按最大吸附量上柱，靜態(tài)吸附4h后水洗至A＜5%A0，按最大解吸率的乙醇濃度，洗至吸光度A＜5%A0。

6）動態(tài)梯度洗脫：取適量活化的樹脂裝柱（30cm×70cm），將九頭獅子草紅色素原液按最大吸附量上柱，靜態(tài)吸附4h后水洗至A＜5%A0，按不同的乙醇濃度（20%、40%、60%、80%和100%），洗至吸光度至A＜5%A0，測定解吸率。

1.3.3 穩(wěn)定性評價

1）溫度的影響：配制濃度為0.1 mg·mL-1的色素溶液，分別取該溶液5mL，在不同溫度（室溫、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）下恒溫1h，冷卻至室溫后測吸光度，評價色素在不同溫度下的穩(wěn)定性。

2）溶液pH值的影響：配制濃度為0.1mg·mL-1的色素溶液，分別取該溶液5mL，調(diào)pH值，并定容到 10mL，使得溶液的 pH 值分別為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，室溫下震蕩 1h 后測吸光度，評價色素在不同pH值下的穩(wěn)定性。

3）常用食品添加劑的影響：配制濃度為0.1mg·mL-1的色素溶液，分別取該溶液5mL，并加入相同體積的1.0%和0.1%的常用食品添加劑溶液（蔗糖、葡萄糖、VC、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、亞硫酸鈉、碳酸氫鈉），室溫震蕩1h后測吸光度，評價色素在常用添加劑溶液中的穩(wěn)定性。

4）常見金屬離子的影響：配制濃度為0.1mg·mL-1的色素溶液，分別取該溶液5mL，加入相同體積、濃度為1.0%的常見金屬離子的鹽溶液（NaCl、KCl、MgSO4、AlCl3、CuSO4、FeCl3），室溫震蕩 1h 后測吸光度，評價色素在常用添加劑溶液中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 九頭獅子草紅色素在可見光范圍的最大吸收波長

準(zhǔn)確稱取1.1210g九頭獅子草紅色素粗品，溶于1L蒸餾水中，進行紫外光譜掃描，溶液在480 nm處有最大吸收波峰（圖1），與蔣紅芝[7]的研究結(jié)果相近。

圖1 九頭獅子草紅色素溶液最大吸收波長

2.2 桂東九頭獅子草紅色素的純化

2.2.1 靜態(tài)吸附用大孔樹脂

分別稱取5.00g的4種不同類型的大孔樹脂置于100mL錐形瓶中[11]，各加入A0=0.906的色素溶液25mL，靜態(tài)吸附24h，取溶液上清液測定吸光度值，根據(jù)式（1）計算出不同類型大孔樹脂的吸附率（表1）。由表1可看出，D-101的吸附率最高為81.18%，AB-8次之，故選擇D-101為純化樹脂。

表1 不同樹脂對九頭獅子草紅色素的靜態(tài)吸附結(jié)果比較

2.2.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取5.00g的D-101樹脂，加入吸光度值為A0=0.501的色素溶液25mL，在25℃下進行吸附，每20 min取上清液測定在480nm處的吸光度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，D-101樹脂對九頭獅子草紅色素有快速的吸附能力，速率變化區(qū)間明顯。

圖2 D-101對九頭獅子草紅色素的靜態(tài)吸附動力學(xué)結(jié)果

2.2.3 最大吸附量的測定結(jié)果

利用式（3）計算出總吸附率，即最大吸附量。D-101樹脂對九頭獅子草紅色素的總吸附率結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著色素體積增大，樹脂在10BV時，總吸附量最大值為12.425，最大吸附量為2.484。

圖3 最大吸附量的測定結(jié)果

2.2.4 不同乙醇濃度對色素的靜態(tài)解吸影響

準(zhǔn)確稱量已吸附色素的大孔樹脂各1.00g，分別加入各個濃度的乙醇溶液10mL，吸附12h后取上清液測480nm處的吸光值，根據(jù)式（2）計算出各個乙醇濃度的解吸率。由圖4可知，乙醇濃度為60%時，樹脂對九頭獅子草紅色素有最佳的解吸效果，解吸率為79.85%。

2.2.5 等度洗脫

準(zhǔn)確稱取10.0050g活化的D-101樹脂裝柱，加入A0=0.723的色素溶液50mL ，靜態(tài)吸附4h后用水洗至A＜5%A0，用60%乙醇濃度洗脫，每20min取洗脫液測定一次吸光度值，直至A＜5%A0，計算各個時間段內(nèi)洗脫液的解吸率。由圖5可知，60%濃度的乙醇在40min前的解吸率上升較快。

圖4 乙醇濃度對九頭獅子草紅色素的靜態(tài)解吸影響

圖5 等度洗脫結(jié)果

2.2.6 梯度洗脫

準(zhǔn)確稱取36.0100g的D-101樹脂裝柱，加入200mL、A0=0.886的色素溶液，靜態(tài)吸附4h后，水洗至A＜5%A0，按式（4）計算出各個乙醇洗出液濃度的收率。由圖6可知，色素多集中在60%乙醇中，40%乙醇次之。因此，梯度洗脫可以更好地分離、純化九頭獅子草紅色素。

圖6 梯度洗脫結(jié)果

2.3 桂東九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響因素

2.3.1 溫度對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

溫度對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響見圖7，可知吸光度隨溫度的變化不大，熱穩(wěn)定性較好。

圖7 溫度對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

2.3.2 溶液pH值對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

由實驗結(jié)果及圖8可知，九頭獅子草紅色素在pH小于8時，顏色隨著酸性的增強發(fā)生紅色→紫紅→紫色的變化；當(dāng)pH在10～14時，顏色為橙黃色?？芍貞?yīng)在弱酸弱堿（pH=5～11）條件下使用，避免在強酸或強堿條件下使用。

圖8 pH對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

2.3.3 常用食品添加劑對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

在九頭獅子草紅色素溶液中加入常見的食品添加劑，測定480nm處的吸光度如表2所示，可見九頭獅子草紅色素在常見的食品添加劑溶液中具有較好的穩(wěn)定性。

表2 常用食品添加劑對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

2.3.4 常見金屬離子對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

常見金屬離子對九頭獅子草紅色素的穩(wěn)定性影響結(jié)果見圖9?？梢娚卦贜a+、K+、Mg2+的溶液中較穩(wěn)定，在Cu2+、Fe3+、Al3+溶液中的吸光度值有較大變化。

圖9 常見金屬離子對九頭獅子草紅色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

采用D-101大孔樹脂純化桂東九頭獅子草紅色素，可獲得純度較高的天然色素。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，其溶液在通常的溫度下能保持穩(wěn)定，在中性溶液或弱酸弱堿性食品添加劑溶液中的穩(wěn)定性較好，在強酸溶液中顏色由紅變紫，在強堿溶液中顏色由紅變黃綠；在常用的食品添加劑溶液中具有較好的穩(wěn)定性。金屬離子對色素溶液有不同的影響，在含 Na+、K+、Mg2+的溶液中穩(wěn)定，在含 Cu2+、Fe3+、Al3+的溶液中，吸光度值有較大變化。九頭獅子草紅色素作為食品添加劑應(yīng)用于食品加工，可獲得較好的顔色效果，因此，開發(fā)和利用九頭獅子草色素產(chǎn)品，將會大大降低合成色素對人體帶來的危害。