從分子水平認(rèn)識及鑒別多原發(fā)肺癌的研究進(jìn)展

李世軒 綜述 王光鎖 審校

肺癌是全世界人類死亡的主要原因，每年約有176萬人死于肺癌[1]。在治療原發(fā)肺癌的期間或隨訪過程中，患者可能會病發(fā)另一肺癌，這將考慮為多原發(fā)肺癌(Multiple Primary Lung Cancer, MPLC)或肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(Intrapulmonary Metastasis，IM)，兩者預(yù)后有差別。多原發(fā)肺癌是指在同一患者肺內(nèi)同時或先后發(fā)生兩個或兩個以上原發(fā)性肺癌。當(dāng)多個腫瘤組織學(xué)相似時，將難以鑒別MPLC和IM；另外，氣腔轉(zhuǎn)移理論的新觀點(diǎn)也為其鑒別增加難度[2-3]；如果繼發(fā)肺癌或者IM發(fā)生在先前用放射治療過的地方，由于放療導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上的變化，則更難區(qū)分兩者。以上均為目前臨床管理MPLC帶來新的挑戰(zhàn)，因此，區(qū)分IM和MPLC是很困難且迫切的。

診斷標(biāo)準(zhǔn)

在1975年，第一個MPLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)是Martini提出來的[4]。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，可區(qū)分同時性(simultaneous MPLC，sMPLC)和異時性多原發(fā)肺癌(metachronous MPLC，mMPLC)。sMPLC指不同腫瘤的獨(dú)自形成過程，他們組織學(xué)上相同或不同，發(fā)生在不同的段、葉或?qū)?cè)肺；組織學(xué)相同時均為原位癌起源，且共同引流的淋巴部位無癌腫；另外，在診斷時sMPLC時需排除肺外轉(zhuǎn)移。mMPLC與sMPLC的區(qū)別在于mMPLC的無瘤間期至少為2年。

在1995年，Antakli等人更新MPLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，即如果多個腫瘤具有不同或相似的組織學(xué)，并且至少符合以下5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)，則可確定MPLC的診斷：(1)不同的組織學(xué)位置；(2)癌前病變；(3)沒有轉(zhuǎn)移；(4)無縱隔浸潤；(5)不同的DNA倍體。

美國胸科醫(yī)師協(xié)會(American College of Chest Physicians，ACCP)對MPLC的標(biāo)準(zhǔn)多次進(jìn)行了補(bǔ)充，比如最新的2013年版本[6]，mMPLC的無瘤間期至少為4年且無全身轉(zhuǎn)移等。

新診斷方法的發(fā)展導(dǎo)致了標(biāo)準(zhǔn)的修改，盡管如此，目前仍然沒有較為準(zhǔn)確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

分子與多原發(fā)肺癌

隨著新診斷方法的日益普及(如CT和PET-CT)，MPLC的發(fā)病率一直在上升，與此同時，肺癌基因組分析、染色體畸變、微衛(wèi)星改變等取得了前所未有的進(jìn)展，以上種種在更深的分子層面中徹底改變了我們對肺癌以及MPLC的認(rèn)識。

一、驅(qū)動基因

肺癌基因組學(xué)的進(jìn)展深刻地改變了我們對肺癌在分子水平上的理解，El-Telbany 等人[7]就肺癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的多個驅(qū)動基因進(jìn)行綜述，其中有EGFR、KRAS、MET、LKB1、BRAF、PIK3CA、ALK、RET和ROS1等。EGFR突變常見于原發(fā)性肺腺癌，少見轉(zhuǎn)移，其基因突變集中在外顯子18、19、20和21的突變，同時在女性患者中可檢測到EGFR基因的多個罕見基因突變[8]，豐富了突變的多樣性；KRAS突變可見于EGFR野生型，與EGFR突變互斥；MET突變常在非小細(xì)胞肺癌中與EGFR突變共表達(dá)；LKB1失活突變與KRAS激活突變可共表達(dá)；BRAF突變通常不伴隨EGFR突變、KRAS突變及ALK易位；PIK3CA、ALK、RET和ROS1在非小細(xì)胞肺癌患者中的突變頻率均較低。

二、區(qū)域性癌化

腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了遺傳因素外，很大程度上是由致癌物質(zhì)決定的，如煙草煙霧和酒精，肺組織長期暴露于這些物質(zhì)導(dǎo)致整個呼吸道的細(xì)胞發(fā)生DNA損害，這其中可能有原癌基因的激活和抑癌基因的失活，經(jīng)過漫長的突變積累，最終發(fā)展為惡性腫瘤。在這一過程中，不同位置的組織細(xì)胞可能發(fā)生不同的基因突變，從而形成獨(dú)立不同克隆來源的多原發(fā)癌，而各個癌灶就表現(xiàn)出具有自身特異性的基因表型[9]。

三、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

目前認(rèn)為肺癌的發(fā)生發(fā)展表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性現(xiàn)在多由主干和分支學(xué)說解釋[10]，在這個模型中，主干基因突變像早期體細(xì)胞突變一樣，在每個亞克隆和每個腫瘤區(qū)域中驅(qū)動著腫瘤的生長；隨著疾病進(jìn)展，早期體細(xì)胞突變的異質(zhì)性像分支突變一樣發(fā)生在原發(fā)病變和/或轉(zhuǎn)移灶中。Pengfei Ma等人[11]提出，雖然多發(fā)肺腫瘤中，細(xì)胞在癌變過程中的突變特異性途徑是隨機(jī)的，但遺傳軌跡可能受到往關(guān)鍵信號通路功能收斂的選擇性限制，強(qiáng)大的進(jìn)化壓力同時導(dǎo)致了癌變的定軌擴(kuò)展及基因組多樣性的限制。

四、MSI和LOH

不管在肺癌的早期或晚期，均可見微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability,MSI)和雜合性丟失(Loss of Heterozygosity,LOH)，這兩種現(xiàn)象都代表了細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)化為惡性的過程中所發(fā)生的分子異常，將可用于區(qū)分播散型原發(fā)腫瘤和繼發(fā)原發(fā)腫瘤，目前正在對多個染色體臂的LOH檢測進(jìn)行研究[12]。

術(shù)前鑒別診斷

術(shù)前診斷肺腫瘤良惡性有多種方法，如CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)、電磁導(dǎo)航系統(tǒng)CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢術(shù)、纖支鏡活檢術(shù)、經(jīng)支氣管內(nèi)鏡超聲針吸活檢術(shù)(EBUS-TBNA)等，多發(fā)肺腫瘤術(shù)前穿刺較少采用，原因考慮有下：(1) 多次穿刺增加出血、氣胸、空氣栓塞及腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險；(2) 多發(fā)肺腫瘤常較小、解剖位置難以穿刺獲取腫瘤組織或定位不準(zhǔn)確導(dǎo)致取樣失??；(3) 根據(jù)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性理論，所取樣本也許不足以全面分析腫瘤免疫組化及基因組改變，但相關(guān)文獻(xiàn)報道[13-15]EBUS可獲取足夠的病理標(biāo)本且足以進(jìn)行全面的分子檢測及基因突變分析；(4)因經(jīng)濟(jì)及患者心理等多種原因，患者及其家屬對術(shù)前多點(diǎn)穿刺的依從性較差等等。目前少見多發(fā)肺腫瘤多點(diǎn)穿刺的文獻(xiàn)報道，不能明確多點(diǎn)穿刺能否幫助鑒別，但隨著穿刺和檢測技術(shù)的發(fā)展，多點(diǎn)穿刺鑒別多發(fā)肺腫瘤的價值在未來值得期待。

鑒別多原發(fā)肺癌和原發(fā)癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移

當(dāng)MPLC存在時，很難與其他器官的癌癥肺轉(zhuǎn)移或者肺原發(fā)性癌的IM區(qū)分開來，隨著多種技術(shù)的發(fā)展及醫(yī)生對肺癌發(fā)生發(fā)展認(rèn)識的加深，目前已有多種方法可資鑒別。

一、數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用

Chen等人[16]提出利用p53, p16, p27 and c-erbB2等四種基因蛋白建立一個定量差異—表達(dá)基因數(shù)學(xué)模型以鑒別MPLC和IM，差異表達(dá)率之和大于90考慮為MPLC，反之則考慮為IM。

二、二代測序技術(shù)的應(yīng)用

近年來發(fā)展迅猛的二代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing，NGS)[17-18]應(yīng)用于多發(fā)肺腫瘤需結(jié)合區(qū)域性癌化[9]及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[10]。Murphy等人[19]提出利用NGS進(jìn)行一項(xiàng)基于配對測序的基因組重排診斷譜系試驗(yàn)，MPLC中多個肺腫瘤無共同基因組重排，而IM則有，從而可資鑒別。

從基因檢測的廣度上考慮，Begg等人[20]認(rèn)為，單個或者少量基因位點(diǎn)是不足以鑒別IM和MPLC，在統(tǒng)計學(xué)上為達(dá)到更高的準(zhǔn)確度，至少需要20個標(biāo)記的基因突變位點(diǎn)來區(qū)別IM和MPLC。同時Girard等人[21]提出，各自的肺癌匹配到相同基因變化的可能性主要決定于基因突變的頻率；即多發(fā)肺腫瘤相同突變所對應(yīng)的基因突變頻率越低，克隆起源相同的可能性越大，同時低頻基因突變的相同數(shù)目越多，克隆起源相同的可能性越大；相反，高頻基因突變相同的患者，診斷他們克隆起源是否相同需更加地謹(jǐn)慎。

Liu等人[22]發(fā)現(xiàn)同一患者不同肺腫瘤均出現(xiàn)EGFR p.L858R突變，EGFR p.L858R突變和外顯子19缺失突變是已知的熱點(diǎn)基因突變[23]，但同時不同肺腫瘤在其他基因位點(diǎn)具有明顯的突變差異；不僅如此，在組織病理類型不同的多發(fā)肺腫瘤中也可檢測到相同的熱點(diǎn)基因突變[24]，最終診斷為IM。另外，多個研究發(fā)現(xiàn)IM中的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的基因突變一致率大于90%[25-26]，而考慮為MPLC的多發(fā)肺腫瘤，其基因突變一致率仍有10.3%-32.6%[8, 25, 27-28]，因此多發(fā)肺腫瘤具有相同熱點(diǎn)基因突變，未必能給鑒別帶來有效證據(jù)，Xiao等人[29]對組織病理類型相似的多發(fā)肺腫瘤進(jìn)行NGS檢測后也驗(yàn)證了該結(jié)論。就目前而言，使用NGS來鑒別MPLC和IM仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法及解釋標(biāo)準(zhǔn)，NGS的局限[19]在于基因面板中的目標(biāo)基因相對較少，并且它無法確定基因融合和拷貝數(shù)的改變，盡管如此，我們?nèi)云诖齆GS在未來對鑒別多發(fā)肺腫瘤不可忽視的潛力。

三、結(jié)合臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、基因組學(xué)的應(yīng)用

僅根據(jù)肺腫瘤形態(tài)學(xué)特征，許多繼發(fā)肺癌被誤診，Schneider等人[30]表示對多發(fā)肺腫瘤進(jìn)行基因組學(xué)和形態(tài)學(xué)的綜合評估是可行的，但目前不足以建立其克隆關(guān)系和預(yù)后。Saab等人[31]更詳細(xì)地指出根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)資料以及形態(tài)學(xué)可鑒別65%的多發(fā)肺腫瘤患者，但生長模式相似和缺乏主要生長模式的肺腫瘤超過三個時，僅憑以上證據(jù)則難以鑒別，而當(dāng)結(jié)合患者的形態(tài)學(xué)特征和基因組學(xué)時，94%的患者則可鑒別。Takahashi等人[25]根據(jù)多發(fā)肺腫瘤患者進(jìn)行NGS檢測后的結(jié)果與Martini標(biāo)準(zhǔn)、組織病理學(xué)進(jìn)行對比分析，診斷一致率僅為43%；去除13個組織病理不確定的患者，NGS的結(jié)果和Martini標(biāo)準(zhǔn)的一致率為63%，說明僅根據(jù)Martini標(biāo)準(zhǔn)診斷MPLC是不足夠的。另外值得注意的是，在組織病理診斷為IM的患者中，與NGS的一致率為86%，但組織病理診斷為MPLC的患者中，與NGS的一致率僅有53%，則當(dāng)組織病理診斷為MPLC時不能完全排除IM。

四、MSI和LOH的應(yīng)用

Shen等人[32]根據(jù)微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)對同一個患者上的2個肺腫瘤進(jìn)行了分子分析，盡管在其中1個微衛(wèi)星標(biāo)記(D2S1363)上確實(shí)存在差異，但在另外5種微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因突變相同，這證實(shí)了經(jīng)組織學(xué)診斷的轉(zhuǎn)移性病灶。因此，不同等位基因和微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)的分子分析可用于鑒別IM和MPLC。

五、PD-L1的應(yīng)用

Haratake 等人[33]對59個患者的152個肺腫瘤進(jìn)行了PD-L1表達(dá)檢測，與IM相比，PD-L1在MPLC中表達(dá)的不一致性更高；另外，在亞洲人群中，IM的EGFR野生型的PD-L1陽性率比EGFR突變型更高，因此通過檢測PD-L1陽性率及一致性水平將提供鑒別的可能。

預(yù) 后

根據(jù)目前的TNM肺癌分類(第8版)[34]，如果多發(fā)腫瘤位于同一葉，則分期為T3；如果多發(fā)腫瘤位于不同的葉，但位于同一側(cè)則為T4；如果多發(fā)腫瘤位于不同側(cè)則為M1a，根據(jù)此分期，多發(fā)肺腫瘤分期均偏晚，提示預(yù)后不良。對于采取外科手術(shù)干預(yù)的MPLC患者，多個研究表明[29, 33, 35-36]這部分患者術(shù)后中位生存期為40-52個月，5年生存率為40.6%-75.6%，以及總生存均優(yōu)于采取手術(shù)治療的IM患者，因此對于多發(fā)肺腫瘤患者，應(yīng)多學(xué)科討論全面評估手術(shù)指征，對考慮為MPLC的患者應(yīng)積極采取外科干預(yù)。另外，目前尚無關(guān)于在MPLC患者術(shù)后輔助化療、放療或靶向治療的隨機(jī)試驗(yàn)或大樣本量回顧性報道，無法明確MPLC和IM患者在術(shù)后輔助治療是否有差異，希望未來的相關(guān)研究能加深對這個問題的了解以指導(dǎo)MPLC術(shù)后的輔助治療，改善MPLC患者的預(yù)后。

結(jié) 語

影像學(xué)及多種術(shù)前診斷方法的飛速發(fā)展，多發(fā)肺腫瘤的檢出率越來越高，而MPLC與IM的鑒別仍是棘手的難題。從分子水平去解析肺癌的發(fā)生發(fā)展，將影響臨床對肺癌以及MPLC的診斷及治療，目前研究尚匱乏，仍需更多的研究來全面精確描述肺癌以及MPLC的特征，并建立相關(guān)信息庫，從而準(zhǔn)確指導(dǎo)該疾病的管理和改善患者的預(yù)后。