適用于結(jié)核分枝桿菌微測序耐藥基因芯片的多重PCR體系的優(yōu)化與評價(jià)

孫照剛 李自慧 張洪靜 孫琦 潘麗萍 張宗德 許紹發(fā)

結(jié)核病耐藥性的快速診斷和全面診斷是當(dāng)前結(jié)核病診斷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前世界衛(wèi)生組織(WHO)主要推薦基于PCR基礎(chǔ)上的Xpert MTB/RIF檢測和線性探針檢測(line probe assays，LPAs)技術(shù)作為耐藥結(jié)核病主要的分子檢測方法。前者雖然能快速、簡便地檢測利福平耐藥，但其主要缺點(diǎn)是費(fèi)用十分昂貴，檢測耐藥種類少[1]；后者可以同時(shí)檢測利福平和異煙肼耐藥，以及新一代的GenoType MTBDRsl可以檢測氟喹諾酮類、氨基糖苷類和乙胺丁醇耐藥，但目前價(jià)格昂貴，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，敏感性也略欠缺[2-4]。由此可見PCR技術(shù)是分子檢測的基礎(chǔ)，優(yōu)化PCR技術(shù)不但可以降低成本，減少誤差，而且減輕技術(shù)操作人員的工作量，提高用戶體驗(yàn)效果。

基因芯片技術(shù)是一類高通量分子檢測技術(shù)，對于PCR操作的每一步節(jié)省或減輕工作量都將大大提高工作效率。耐藥結(jié)核病基因芯片檢測是WHO認(rèn)可的用于結(jié)核分枝桿菌(M.tb)耐藥性檢測的分子生物學(xué)方法[5]。前期我們報(bào)道了本課題組研發(fā)的微測序基因芯片技術(shù)[6]以及相應(yīng)的一種多重PCR方法[7]，本研究擬進(jìn)一步對前期建立的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并評價(jià)其在利用結(jié)核分枝桿菌微測序耐藥基因芯片進(jìn)行耐藥性臨床檢測中的優(yōu)缺點(diǎn)。

資料與方法

一、標(biāo)本來源

結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于本單位的北京結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫。痰標(biāo)本來源于臨床檢驗(yàn)后的剩余標(biāo)本。

二、臨床分離株基因組DNA的提取

采用DNA小量提取試劑盒(51304，Qiagen公司)按操作說明提取菌株DNA。簡單操作如下：用TE緩沖液(pH8.0，含Tris-Cl 0.1 mmol/ L)，EDTA 0.5 mmol/ L重懸細(xì)菌，加入溶菌酶至5 mg/mL，37℃過夜振蕩消化，加入蛋白酶K至終濃度1 mg/mL，加入10% SDS至終濃度1%，37℃振蕩1小時(shí)，之后根據(jù)操作說明書進(jìn)行過柱分離純化基因組DNA，并最終溶解于適量無菌去離子水，用Nanodrop2000(美國Thermo Scientific)進(jìn)行定量檢測后，貯存于-20℃。

三、耐藥相關(guān)基因的引物合成

參考文獻(xiàn)[7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成。擴(kuò)增的基因包括rpoB(409bp)、katG(635bp)、mabA/inhA(248bp)、embB(1111bp)、gyrA(423bp)、rpsL(373bp)、rrs(516 bp)和eis(567 bp)，以及pncA(上游：5′-GGTCATGTTCGCGATCGTCG-3′和下游:5′-ACAGTTCATCCCGGTTCGGC-3′，689 bp)各引物對擴(kuò)增的條帶大小在凝膠電泳時(shí)區(qū)分較為明顯。

四、PCR擴(kuò)增及測序

PCR擴(kuò)增采用的Taq酶購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(CW0654A)，dNTP購于天根生化科技(北京)有限公司(CD111-02)。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產(chǎn)物的雙向測序。采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。為便于計(jì)算成本，所用的耗材0.5～10μL盒裝滅菌短吸頭、200μL槍尖(無RNase)、96孔PCR反應(yīng)板及其封口膜等均購自Axygen公司。每個(gè)樣品重復(fù)2次，共做了3批144個(gè)標(biāo)本，每批操作為48個(gè)標(biāo)本。采用(NH4)2SO4來調(diào)節(jié)NH4+的濃度，同時(shí)采用二甲基亞砜(DMSO)，兩者都具有促進(jìn)特異性PCR反應(yīng)的作用。

五、主要儀器

生物安全柜(NU-425-300E，美國Nuaire公司)，基因擴(kuò)增儀(My Cycler，美國Bio-rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR，美國Bio-rad公司)，核酸分析儀(Nanodrop2000，美國Thermo公司)

結(jié) 果

一、九個(gè)耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增的單管PCR擴(kuò)增

根據(jù)引物的設(shè)計(jì)結(jié)果，煺火溫度采用62℃，反應(yīng)體系為常規(guī)反應(yīng)體系(表1)，每條引物的摩爾數(shù)基本相同。由(圖1)可以看出，各基因的PCR產(chǎn)物亮度不同。根據(jù)亮度，我們推測在該煺火溫度下，各引物對都能正常與模板結(jié)合，但是效率不同。因此，為了達(dá)到各基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物接近相同，我們在多重PCR反應(yīng)體系中需要調(diào)整引物的比例。

表1 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的擴(kuò)增普通PCR反應(yīng)體系

圖1 濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳

1～10分別為：空白對照、katG、inhA reg、rpoB、gyrA、rrs、embB、rpsL、pncA、eis。M,marker，條帶分別2000/1000/750/500/250/100 bp。

二、多重PCR擴(kuò)增

1 多重PCR(2管擴(kuò)增9個(gè)目的基因) 根據(jù)所擴(kuò)增的9個(gè)目的基因的片段大小，我們對多重PCR所用的引物進(jìn)行了合理組合。圖2 顯示的是分別采用6:3組合(圖2 A)和5:4組合(圖2 B)都能收到良好的擴(kuò)增效果。但是5:4組合的電泳結(jié)果更清楚。經(jīng)二代測序證明，各產(chǎn)物之間比例恰當(dāng)，產(chǎn)物為需要擴(kuò)增的目的基因。

圖2 濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳

1包含6對基因引物(具體名稱省略)；2包含3對基因引物(具體名稱省略)；3包含5對基因引物(具體名稱省略)；4包含4對基因引物(具體名稱省略)。 M1,marker，條帶分別600/500/400/300/200/100 bp；M2,marker，條帶分別2000/1000/750/500/250/100 bp。

3 耐藥基因擴(kuò)增多重PCR體系的痰標(biāo)本驗(yàn)證 采用135株臨床分離株進(jìn)行DNA提取后的PCR擴(kuò)增，結(jié)果所有標(biāo)本均能清楚的看到9條目的基因條帶。對150個(gè)臨床痰標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，經(jīng)Nanodrop測定核酸的量發(fā)現(xiàn)有DNA的陽性標(biāo)本為36個(gè)，PCR擴(kuò)增和電泳的結(jié)果證明有大約29(80.56%)的標(biāo)本能夠擴(kuò)增出目的條帶，其余標(biāo)本擴(kuò)增不全，缺少個(gè)別的條帶。

表2 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

注：根據(jù)前期PCR產(chǎn)物中各條帶的亮度，調(diào)整引物的量，增加弱帶的引物量，降低強(qiáng)帶的引物量。

圖3 濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳

1包含5對基因引物；2包含4對基因引物。3包含6對基因引物；4包含3對基因引物； M1,marker，條帶分別600/500/400/300 bp；M2,marker，條帶分別1000/750/500/250 bp。

4 耐藥基因擴(kuò)增多重PCR體系的效率優(yōu)勢 與每個(gè)耐藥基因都需要單管PCR擴(kuò)增相比，本研究創(chuàng)立的多重PCR擴(kuò)增方法能夠縮短操作時(shí)間，減少所用耗材，提高擴(kuò)增效率，減少人為操作失誤率。此外，在需要樣品運(yùn)輸至第三方檢驗(yàn)時(shí)還可以節(jié)省物流成本。

表3 平均每48個(gè)標(biāo)本的操作效率比較

討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測芯片是一種高通量的檢測多藥耐藥的芯片技術(shù)，該技術(shù)目前主要以雜交法為主[8-10]，但是雜交法具有操作復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，而以微測序技術(shù)為原理的芯片技術(shù)，能夠較好的克服了芯片檢測技術(shù)的多數(shù)缺點(diǎn)。前期我們的研究結(jié)果表明微測序耐藥基因檢測芯片具有較好的敏感性、特異性和一致性，此外，微測序芯片技術(shù)傳統(tǒng)的雜交法芯片檢測技術(shù)具有操作方面、快速等優(yōu)點(diǎn)。本研究針對微芯片耐藥檢測技術(shù)中利用PCR制備芯片檢測樣本環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化操作和成本計(jì)算等評價(jià)，以提高對微測序基因芯片檢測結(jié)核耐藥性的認(rèn)識。

為了驗(yàn)證優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系，本研究分別以羅氏培養(yǎng)的菌體和痰菌為研究對象，經(jīng)過Nanodrop驗(yàn)證，全部的培養(yǎng)菌株都可以提取到基因組DNA并且多重PCR能夠擴(kuò)增出所有條帶；而經(jīng)nanodrop確認(rèn)后的痰標(biāo)本有80.56%能夠擴(kuò)增出全部條帶，多重PCR不能擴(kuò)增出的條帶沒有規(guī)律性，是否與模板量有關(guān)尚需進(jìn)一步研究[13]。本研究雖然對多重PCR的成本進(jìn)行了計(jì)算，但是本研究中的計(jì)算僅僅是為了有一個(gè)比較，并不具有完全的價(jià)格代表性。例如，多重PCR操作時(shí)間受所用加樣設(shè)備和試驗(yàn)條件的影響較大；耗材和試劑受產(chǎn)地以及供貨渠道的影響也較大，而失誤次數(shù)更是與操作人員有密切關(guān)系。但是這并不影響對多重PCR具有優(yōu)勢的判斷。對多重PCR體系的優(yōu)化應(yīng)當(dāng)還具有一定的進(jìn)步空間，但是本研究只做了關(guān)鍵部分嘗試，今后還需進(jìn)一步完善和改進(jìn)。