CHO細(xì)胞中通過(guò)基因過(guò)表達(dá)提高治療性蛋白產(chǎn)量的策略

周 琴，韓倩倩，張?zhí)m蘭 ，吳朋飛，馬冰冰，馬騰飛，徐昌志，張部昌

(1. 安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，合肥 230601; 2. 安徽天祥糧油食品有限公司，阜陽(yáng) 236300)

治療性蛋白在病毒感染、自身免疫疾病、臨床惡性腫瘤等治療方面取得了顯著療效，其中抗體藥物占比居多。自從1986年第一個(gè)治療性抗體進(jìn)入臨床以來(lái)，抗體藥物行業(yè)得到了迅猛發(fā)展。截至2017年上半年，全球抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)到490億美元，國(guó)外市場(chǎng)容量快速攀升，同時(shí)國(guó)內(nèi)抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模也在逐年遞增[1]。用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人胚胎腎細(xì)胞HEK293、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞PERC6、非洲綠猴腎細(xì)胞COS-7、小鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO和SP2/0和CHO細(xì)胞等。其中，近70%的重組蛋白藥物是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)的[2]，這主要得益于以下幾點(diǎn)：1)具有與人相似的翻譯后修飾功能；2)FDA監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可以及清晰的歷史背景；3)內(nèi)源性蛋白分泌極少；4)很容易在化學(xué)定義的無(wú)血清培養(yǎng)基中適應(yīng)高密度懸浮生長(zhǎng)；5)比其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系更不容易感染病毒；6)利用二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)和谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase, GS)基因擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行篩選，有利于外源基因的表達(dá)。該細(xì)胞可塑性好，易于改造并能高效表達(dá)外源蛋白，已用于生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、組織活化遺傳因子、凝血因子等生物蛋白的生產(chǎn)。

如今，CHO細(xì)胞已成為重組蛋白制造業(yè)的首選宿主。CHO細(xì)胞工廠穩(wěn)定性的改善仍是滿足日益增長(zhǎng)的治療性蛋白質(zhì)需求的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，在重組蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中還有許多限速步驟仍有待解決，需要開(kāi)發(fā)和采用新的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程。通過(guò)傳統(tǒng)方法優(yōu)化培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基，可提高細(xì)胞增殖或最大可存活細(xì)胞密度(Viable cell density，VCD)[3]。此外，通過(guò)基因工程方法提高CHO工程細(xì)胞株的性能也經(jīng)過(guò)大量的細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)得以實(shí)現(xiàn)并成功應(yīng)用[4]。這些方法包含了過(guò)表達(dá)有利基因通過(guò)敲除或siRNA/shRNA介導(dǎo)的敲低作用對(duì)不利基因產(chǎn)物進(jìn)行抑制等方法。其中過(guò)表達(dá)技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，副作用較低，是一種高效的基因工程改造手段。該方法的基本步驟包括：1)將有益的功能基因穩(wěn)定地整合到基因組上；2)從多克隆池里分出單克隆細(xì)胞，從而獲得表達(dá)高而穩(wěn)定的工程細(xì)胞。

1 控制細(xì)胞的增殖和死亡

1.1 過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因

在生物加工過(guò)程中，細(xì)胞特異性的生產(chǎn)力降低通常與細(xì)胞增殖加快導(dǎo)致的生長(zhǎng)周期縮短有關(guān)。生產(chǎn)階段的延長(zhǎng)促進(jìn)了細(xì)胞生物量的快速累積，而生產(chǎn)階段的特點(diǎn)是細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的提高。結(jié)合這個(gè)理論，Doolan等[5]比較了生長(zhǎng)快慢不同的兩種CHO工程細(xì)胞株，采用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)分析得出含纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP)對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和存活率具有重大影響，過(guò)表達(dá)VCP最終使得細(xì)胞的存活密度提高了20%～30%。Lin等[6]通過(guò)過(guò)表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員Serpinb1，VCD和IgG單位體積產(chǎn)量分別提高了1.3倍和2.0倍。Darrin和Mohamed[7]在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)促細(xì)胞分裂癌基因c-myc，結(jié)果在沒(méi)有額外的營(yíng)養(yǎng)供給條件下將VCD提高了近70%。Mahameed和Tirosh[8]結(jié)合定向進(jìn)化的理論，證明過(guò)表達(dá)突變型酪氨酸激酶受體KIT(D816V)能夠賦予細(xì)胞高度的增殖能力和對(duì)激酶抑制劑的抵抗能力。工業(yè)生產(chǎn)常常受到培養(yǎng)后期細(xì)胞增殖太快和營(yíng)養(yǎng)限制的約束，因此采用流加培養(yǎng)的工藝會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，但是由此帶來(lái)的成本很高。通過(guò)過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因使細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大活細(xì)胞密度從而提高產(chǎn)量不失為一種高效低成本的手段。

1.2 過(guò)表達(dá)抗凋亡相關(guān)基因

克服凋亡來(lái)提高細(xì)胞生產(chǎn)能力是有效生產(chǎn)治療蛋白廣泛應(yīng)用的策略之一[9]。通過(guò)建立過(guò)表達(dá)抗凋亡基因的穩(wěn)定細(xì)胞系，使細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)，可以提高重組蛋白的產(chǎn)量[10]。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染抗凋亡基因Bcl-x的CHO細(xì)胞中，抗PD1抗體的總產(chǎn)量增加約82%，在轉(zhuǎn)染抗凋亡基因Mcl-1的CHO細(xì)胞中，抗體總產(chǎn)量增加34%。Sauerwald 等[12]證明過(guò)表達(dá)X-連鎖凋亡抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)可促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和延長(zhǎng)培養(yǎng)壽命，同時(shí)可提高生產(chǎn)力。Majors等[13]通過(guò)表達(dá)一種突變的Bcl-XL基因，可以提高CHO細(xì)胞的抗凋亡能力。研究人員還利用其他抗凋亡基因如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、凋亡抑制基因Aven、Fas凋亡途徑抑制分子(Fas apoptotic inhibitory molecule, FAIM)等來(lái)抑制凋亡[14]。最新報(bào)道指出，在促凋亡條件下，外泌體增強(qiáng)了細(xì)胞的活性。由于外泌體來(lái)源于CHO細(xì)胞本身，因此抑制細(xì)胞凋亡不僅有利于提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)力，還能減少安全顧慮[15]。綜上，為了使細(xì)胞適應(yīng)工業(yè)化長(zhǎng)期大規(guī)模培養(yǎng)，過(guò)表達(dá)抗凋亡基因能夠有效提高細(xì)胞的抗凋亡能力，進(jìn)而提高重組蛋白的產(chǎn)量，但是與此帶來(lái)的細(xì)胞株篩選困難也會(huì)隨之增加。

1.3 過(guò)表達(dá)自噬相關(guān)基因

自噬能使哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)自身細(xì)胞器和其他細(xì)胞成分降解而產(chǎn)生能量，在生產(chǎn)過(guò)程中，饑餓條件也會(huì)誘導(dǎo)CHO細(xì)胞自噬[16]。CHO細(xì)胞工程可以同時(shí)靶向自噬和凋亡途徑，已經(jīng)有報(bào)道過(guò)表達(dá)AKT、Bcl-XL或者共表達(dá)Bcl-2和Beclin1來(lái)減緩自噬，延長(zhǎng)培養(yǎng)壽命[17-19]。然而，僅僅通過(guò)過(guò)表達(dá)自噬通路基因ATG9A的方法來(lái)單純調(diào)節(jié)自噬的策略無(wú)法影響自噬，因此這些手段并沒(méi)有增加CHO細(xì)胞中的治療性蛋白產(chǎn)量[20]。充分了解其分子基礎(chǔ)，還有待深入研究，并最終有助于發(fā)現(xiàn)適合利用細(xì)胞工程改造的自噬相關(guān)基因。

1.4 過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期相關(guān)基因

將細(xì)胞周期阻滯在G1期能夠帶來(lái)普遍產(chǎn)量提高的功效[21]。細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑、細(xì)胞周期素依賴性激酶以及細(xì)胞周期素有關(guān)[22]。基于這一點(diǎn)，Pratik等[23]證明共過(guò)表達(dá)細(xì)胞周期依賴性激酶3(Cyclin-dependent kinases 3, CDK3)和細(xì)胞色素c氧化酶第15亞基(Cytochrome oxidase 15, COX15)可增加活細(xì)胞密度。Meents等[24]將p27KIP1和p21CIP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)生產(chǎn)分泌型堿性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)的工程CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的提高。Carvalhal等[25]研究證明p21CIP1過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞周期和生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)力，同時(shí)增加線粒體和核糖體的細(xì)胞體積和生物發(fā)生量。Lee等[26]通過(guò)過(guò)表達(dá)野生型和突變型CHO細(xì)胞周期調(diào)控因子(Cell division cycle 25A, CDC25A)，發(fā)現(xiàn)突變的CDC25A過(guò)表達(dá)克隆表現(xiàn)比野生型高約20%的比生產(chǎn)率。過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期的基因顯著抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，加大了細(xì)胞株篩選工作的困難，但是能顯著提高產(chǎn)量，這可能與代謝消耗的增加伴隨著氧氣、谷氨酰胺、葡萄糖和胞內(nèi)AMP/ADP/ATP的消耗有關(guān)。

2 控制細(xì)胞的代謝和分泌

2.1 過(guò)表達(dá)提高代謝相關(guān)基因

CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中氨和乳酸的積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量有不利的影響。調(diào)控參與細(xì)胞代謝基因的表達(dá)是提高CHO生產(chǎn)細(xì)胞性能的重要手段。為了減少谷氨酰胺產(chǎn)生的氨，Zhang等[27]構(gòu)建了一種重組CHO細(xì)胞表達(dá)谷氨酰胺合成酶來(lái)催化谷氨酸和氨生成谷氨酰胺，使得重組蛋白產(chǎn)量提高了18%。乳酸是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中重要的代謝產(chǎn)物之一，高乳酸水平是由高氧糖酵解引起的，也稱為沃伯格效應(yīng)，并通常與不良的培養(yǎng)性能有關(guān)，因此，為提高生長(zhǎng)、生產(chǎn)力和加工穩(wěn)健性，減少乳酸的積累已成為細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展中的一個(gè)持續(xù)挑戰(zhàn)[28]。改變與丙酮酸代謝途徑有關(guān)的幾種遺傳調(diào)控策略也多次被報(bào)道，Chong等[29]在代謝學(xué)的研究中證明了過(guò)表達(dá)蘋果酸脫氫酶Ⅱ(Malate dehydrogenase, MDHⅡ)使得整體存活細(xì)胞數(shù)提高了1.9倍。Tabuchi等[30-31]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者共表達(dá)?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶均能將CHO細(xì)胞的產(chǎn)抗能力提高到47%以上。因此，過(guò)表達(dá)代謝相關(guān)基因可以有效提高細(xì)胞面對(duì)代謝廢物等的抗壓能力，從而提高產(chǎn)量。

2.2 過(guò)表達(dá)促進(jìn)分泌相關(guān)基因

在CHO工程細(xì)胞中穩(wěn)定插入基因來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞蛋白的生物合成量或者分泌功能可以顯著提高治療性蛋白的產(chǎn)量。例如過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)、DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34(Growth arrest and DNA damage inducible gene 34, GADD34)可以將重組人抗凝血酶III(Antithrombin III, AT-III)的產(chǎn)量提高1.4～2倍[32-33]。在一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子YY1也能將產(chǎn)量提高6倍[34]。這種正效應(yīng)導(dǎo)致的產(chǎn)量提高被證明是轉(zhuǎn)錄后的翻譯修飾及分泌功能加強(qiáng)所引起的。隨著一些復(fù)雜、難表達(dá)的治療性蛋白的需求量增加，一些策略也已經(jīng)慢慢開(kāi)始被開(kāi)發(fā)出來(lái)，為臨床研究和市場(chǎng)供應(yīng)提供一些素材。Pybus等[35]報(bào)道了共表達(dá)免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Immunoglobulin binding protein, BIP)、激活轉(zhuǎn)錄因子6C(Activating transcription factor 6C, ATF6C)和X-Box結(jié)合蛋白1(X-Box binding protein 1, XBP1)可以提高CHO細(xì)胞對(duì)一些難表達(dá)抗體的表達(dá)能力。Le等[36]還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)策略來(lái)克服難表達(dá)治療性蛋白的局限性，他們通過(guò)過(guò)表達(dá)人信號(hào)受體蛋白14(Signal receptor protein 14, SRP14)來(lái)提高細(xì)胞的分泌能力。科學(xué)家們進(jìn)一步利用基因編輯技術(shù)來(lái)探索靶向分泌途徑的各種不同基因，從而提高治療性蛋白的分泌。例如過(guò)表達(dá)蛋白二硫化物異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase, PDI)[37]、神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ceramide transfer protein, CERT)[38]、突觸小體相關(guān)蛋白23(Synaptosomes-associated protein of 23 ku, SNAP-23)[39]等都被證明可以提高治療性蛋白的產(chǎn)量。因此，過(guò)表達(dá)促進(jìn)分泌相關(guān)的基因能夠顯著提高一些難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量。

3 控制細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后翻譯

針對(duì)某一個(gè)基因進(jìn)行編輯存在一定的局限性，也有一些研究同時(shí)過(guò)表達(dá)兩個(gè)基因[11, 17]，但同時(shí)過(guò)表達(dá)兩個(gè)，甚至超過(guò)兩個(gè)基因時(shí)會(huì)過(guò)多占用細(xì)胞翻譯資源，從而限制了重組蛋白產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。篩選并應(yīng)用具有多種功能的潛在分子成為一種研究方向。同時(shí)，近些年小分子RNA的研究成為熱點(diǎn)[40-42]。因?yàn)樾》肿覴NA不占用細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯資源，不會(huì)給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度施加壓力，并且能夠靶向多個(gè)基因，達(dá)到同時(shí)編輯多個(gè)效應(yīng)基因的效果，成為一種高效的基因工程手段。例如過(guò)表達(dá)miRNA-17、miRNA-2861、miRNA-1287、miRNA-483等均能夠有效提高重組蛋白的產(chǎn)量[43-46]；過(guò)表達(dá)miRNA-557可以使難表達(dá)蛋白的效價(jià)提高兩倍以上[47]；過(guò)表達(dá)整個(gè)miR-30家族均能增強(qiáng)CHO細(xì)胞中的重組蛋白生產(chǎn)[48]；過(guò)表達(dá)miRNA-143靶向有絲分裂原激活蛋白激酶7(Mitogen-activated protein kinase, MAPK7) 來(lái)顯著提高蛋白產(chǎn)量，而不會(huì)對(duì)重組CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活率產(chǎn)生負(fù)面影響[49]。與此同時(shí)，該方法也存在一定缺陷，正因?yàn)樾》肿覴NA的靶點(diǎn)多，副作用不明確，因此關(guān)于過(guò)表達(dá)miRNA方向的研究還有待進(jìn)一步挖掘。

4 控制細(xì)胞對(duì)抗體的糖基化修飾

雖然由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的治療性重組蛋白通常被認(rèn)為是安全的，可以用于人類疾病治療，但是人們認(rèn)為其表現(xiàn)出的與人類類似但并不相同的翻譯后修飾還不足夠充分[50]，因此在CHO細(xì)胞中已經(jīng)采用不同的基因工程方法來(lái)修飾生產(chǎn)出來(lái)的重組蛋白的糖基化模式[51]。和人源、鼠源細(xì)胞相比，CHO不能表達(dá)半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase, α-2,6(ST6GAL))，只能表達(dá)半乳糖苷唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase, α-2,3(ST3GAL))，因此CHO細(xì)胞本身就不能產(chǎn)生具有相似末端唾液酸含量的糖蛋白[52]。Fukuta等[53]通過(guò)過(guò)表達(dá)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(N- acetylglucosaminyltransferase III, GnTⅢ)證明改善GLCNAC殘基的糖鏈比例對(duì)治療有積極作用。Jassal等[54]證明在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)不同物種(人類、倉(cāng)鼠、小鼠)的ST6GAL可以增強(qiáng)重組蛋白N端唾液酸糖基化修飾。

5 結(jié)語(yǔ)

近20年來(lái)，基因工程已成為CHO細(xì)胞生物學(xué)中一門強(qiáng)大而多功能的學(xué)科。迄今為止，在最大存活細(xì)胞密度和產(chǎn)量方面的非凡進(jìn)展，很大一部分歸功于基因過(guò)表達(dá)策略在CHO細(xì)胞工程中的應(yīng)用。以上對(duì)過(guò)表達(dá)不同的基因進(jìn)行了概述，其中過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因能夠在快速培養(yǎng)模式下，以最短時(shí)間達(dá)到最大VCD從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的快速生產(chǎn)；而過(guò)表達(dá)抗凋亡基因在工業(yè)大規(guī)模持續(xù)培養(yǎng)的模式下是提高產(chǎn)量最普遍、最常用的一種策略，但是也存在一定缺陷，例如細(xì)胞的增殖緩慢，細(xì)胞株的篩選周期較長(zhǎng)；過(guò)表達(dá)與自噬相關(guān)基因也能提高重組蛋白的產(chǎn)量，但是自噬不是最主要的死亡形式，因此其應(yīng)用存在一定局限性；過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期相關(guān)基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響目前存在爭(zhēng)議，表現(xiàn)為明顯的生長(zhǎng)抑制，與此同時(shí)增加了單克隆細(xì)胞株篩選的難度；對(duì)于一些難表達(dá)的治療性蛋白，過(guò)表達(dá)與代謝和分泌相關(guān)的基因可以明顯提高其產(chǎn)量；過(guò)表達(dá)與糖基化修飾相關(guān)的基因是提高完整型IgG形式的一個(gè)途徑。為實(shí)現(xiàn)同時(shí)改變細(xì)胞的多種功能，同時(shí)過(guò)表達(dá)多個(gè)基因也能夠改善細(xì)胞性能從而提高產(chǎn)量，但是會(huì)引入過(guò)多的抗性基因，占用細(xì)胞內(nèi)翻譯資源。因此，篩選具有多種功能的單個(gè)基因成為研究的熱點(diǎn)。新的研究方向主要為兩方面：1)以腫瘤進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的定向突變基因作為靶點(diǎn)；2)近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在CHO細(xì)胞中發(fā)揮顯著作用，miRNA工程以及其他非編碼RNA如circRNA、link RNA、 lncRNA等還有很大的探索空間，未來(lái)將進(jìn)一步拓展CHO細(xì)胞工程涉及的過(guò)表達(dá)基因的靶點(diǎn)范圍。