中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)在抗病毒免疫作用中的研究進(jìn)展與展望

李汶霖,李淑凝,王 洋,沈海娥,李志敏

(華北理工大學(xué)a.臨床醫(yī)學(xué)院;b.生命科學(xué)學(xué)院;c.護(hù)理與康復(fù)學(xué)院,中國(guó)河北 唐山 063210)

中性粒細(xì)胞作為抵御病原體入侵的第一道防線,具有廣泛的抗菌功能。活化的中性粒細(xì)胞釋放含有抗菌因子的顆粒,并通過(guò)氧化裂解產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[1]。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)是近些年發(fā)現(xiàn)的新的抗菌機(jī)制,該機(jī)制不同于凋亡和壞死,而是一種特殊類(lèi)型程序性細(xì)胞死亡,這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為NETosis[2～3]。在這個(gè)過(guò)程中,中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核失去其特征性的形狀,染色質(zhì)發(fā)生去致密化[4],隨后,細(xì)胞核的膜和顆粒崩解,混合在一起,最終中性粒細(xì)胞釋放NETs。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)主要由染色質(zhì)組成,附著有大量的各種殺菌蛋白質(zhì),例如抗菌肽、蛋白酶、瓜氨酸化組蛋白等。NETs可以包裹、捕捉并殺死病原體,特別是不易被吞噬的白色念珠菌和牛分枝桿菌聚集體這種結(jié)構(gòu)較大的微生物[5]。NETosis的經(jīng)典途徑需要由NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS,然而在缺乏NADPH氧化酶的情況下,線粒體ROS產(chǎn)生也可以觸發(fā)NETosis[6]。此外,金黃色葡萄球菌可引起一種非常迅速并無(wú)需ROS的NETosis[7～8],在金黃色葡萄球菌的直接作用下,中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核迅速變圓和濃縮,通過(guò)囊泡出芽的方式,釋放出NETs的成分。這個(gè)未有ROS參與的過(guò)程說(shuō)明NETs的形成并不一定依賴(lài)于ROS的觸發(fā)作用,可以認(rèn)為這是一種NETosis的特殊途徑。一直以來(lái),研究者都認(rèn)為NETosis需要中性粒細(xì)胞的破裂死亡,而相關(guān)研究觀察到,在沒(méi)有中性粒細(xì)胞死亡的情況下,機(jī)體也可以觸發(fā)NETosis,這種不同途徑的NETosis打破了中性粒細(xì)胞的死亡是NETosis必要條件的觀點(diǎn)[9～11]。當(dāng)然,這種不同于經(jīng)典途徑的NETosis的具體機(jī)制和生理意義還有待闡明。

越來(lái)越多的證據(jù)表明中性粒細(xì)胞在抗病毒免疫反應(yīng)中起重要作用[12～13],而由病毒誘導(dǎo)的NETs既可以控制病毒又能損傷宿主[14]。NETs的抗病毒免疫機(jī)制較抗其他微生物更為復(fù)雜,除了類(lèi)似抗細(xì)菌的機(jī)制:依靠氧化物和非氧化物直接殺傷病毒體;通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹、限制病毒的擴(kuò)散,NETs還可以通過(guò)間接刺激其他的免疫細(xì)胞來(lái)發(fā)揮抗病毒免疫作用,比如:激活漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)[12];降低T淋巴細(xì)胞的激活閾值以提高機(jī)體的抗病毒適應(yīng)性免疫[13]。在NETs發(fā)揮抗病毒作用的同時(shí),它也會(huì)給機(jī)體帶來(lái)許多嚴(yán)重的“副作用”,隨著這些病理反應(yīng)機(jī)制逐漸清楚,人們意識(shí)到NETs的大量形成會(huì)造成許多疾病,比如自身免疫性疾病、呼吸困難和血栓形成等[15～16],因此有人通過(guò)減少和控制NETosis的發(fā)生來(lái)減輕這些嚴(yán)重的“副作用”。本文就病毒與NETs之間的相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1 病毒誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生的機(jī)制

許多病毒在體外實(shí)驗(yàn)中可以直接刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生少量的NETs,中性粒細(xì)胞表面和內(nèi)含體上表達(dá)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)在 NETosis中起著重要作用[17～18]。例如:中性粒細(xì)胞通過(guò)內(nèi)含體上的PRRs,如Toll樣受體7/8(Toll-like receptor 7/8,TLR7/8),識(shí)別HIV-1病毒核酸,發(fā)生NETosis[19];呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的融合蛋白通過(guò)TLR4誘導(dǎo)小鼠發(fā)生NETosis[20];漢坦病毒(hantavirus)介導(dǎo)的NETosis是通過(guò)β2整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的[15];流感病毒A也能刺激中性粒細(xì)胞直接釋放NETs,但相關(guān)機(jī)制尚未確定[21]。值得注意的是,甲型流感病毒誘導(dǎo)的NETs不能防止繼發(fā)性細(xì)菌感染[22],這說(shuō)明病毒誘導(dǎo)的NETs在結(jié)構(gòu)和功能上與細(xì)菌感染時(shí)產(chǎn)生的不同,也說(shuō)明NETs的蛋白質(zhì)成分取決于誘導(dǎo)刺激的類(lèi)型[23]。在病毒感染的情況下,中性粒細(xì)胞可以啟動(dòng)除NETosis以外的其他抗病毒機(jī)制,例如釋放抗病毒分子或吞噬作用,甚至啟動(dòng)凋亡程序[24],但目前還不清楚中性粒細(xì)胞是怎樣判斷誘因并決定這些不同機(jī)制的產(chǎn)生,可能不是單個(gè)受體的作用,而是中性粒細(xì)胞多個(gè)受體的隨機(jī)組合決定了中性粒細(xì)胞的抗病毒作用方式。此外,中性粒細(xì)胞中僅僅有一部分細(xì)胞發(fā)生了NETosis,這表明僅有部分特殊亞型的中性粒細(xì)胞易受誘導(dǎo)發(fā)生NETosis,而不是所有中性粒細(xì)胞都能發(fā)生[4]。有研究報(bào)道,病毒也可以通過(guò)不與PRRs結(jié)合的方式間接誘導(dǎo)NETosis,病毒感染的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥環(huán)境含有細(xì)胞因子和趨化因子,如白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、Ⅰ型干擾素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ),這些因子可促使 NETs形成[3,25～26]。

研究表明,血小板在抗病毒防御中起著重要作用,并且其作用與NETs有關(guān)[27]。在病毒感染過(guò)程中研究者經(jīng)常觀察到血小板的活化過(guò)程,例如:來(lái)自小RNA病毒科的單鏈正義RNA病毒通過(guò)TLR7激活血小板,活化的血小板與中性粒細(xì)胞形成聚集體,其分子機(jī)制為活化血小板上的CD41與中性粒細(xì)胞上的β2整合素CD11b相互作用,最終誘導(dǎo)、產(chǎn)生NETosis,這一作用可有效地降低病毒滴度并提高宿主的存活率[28～30]。血小板和中性粒細(xì)胞聚集體的大量生成以及NETs的出現(xiàn)可能代表著宿主應(yīng)對(duì)大量繁殖病毒的一種緊急狀態(tài),例如由漢坦病毒引起的病毒性出血熱(viral hemorrhagic fever,VHF)[31～32]。

2 NETs的抗病毒作用

雖然病毒誘導(dǎo)NETs形成的機(jī)制現(xiàn)在已經(jīng)研究較多,但NETs對(duì)抗病毒的免疫作用尚未完全闡明。在感染痘病毒的小鼠模型中,感染前用脂多糖誘導(dǎo)的NETs大大減少了病毒感染的肝細(xì)胞的數(shù)量,而這種保護(hù)作用可被DNase處理減弱[30]。NETs產(chǎn)生抗病毒作用的機(jī)制主要有以下3種:1)NETs的網(wǎng)狀染色質(zhì)骨架結(jié)合并固定病毒顆粒,從而機(jī)械地防止病毒傳播,其中部分作用是通過(guò)靜電引力來(lái)實(shí)現(xiàn)的,NETs組蛋白富含帶正電荷的氨基酸,在靜電作用下可附著在帶負(fù)電荷的病毒包膜上[19]。研究報(bào)道,核心組蛋白H3和H4既可以誘導(dǎo)季節(jié)性流感A顆粒聚集,也可以使HIV-1失活[19,33],細(xì)胞外組蛋白能減少HIV-1的轉(zhuǎn)錄[34],組蛋白H1與諾沃克病毒(Norwalk virus)結(jié)合,可防止它們附著在腸細(xì)胞上[35];2)附著于NETs的染色質(zhì)骨架存在抗菌分子,如髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、抗菌肽和α-防御素,它們對(duì)包膜病毒和非包膜病毒都有抗病毒活性[36];3)NETs組分通過(guò)刺激并激活其他免疫細(xì)胞的抗病毒機(jī)制,間接發(fā)揮抗病毒作用。例如:組蛋白和高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)作為損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),觸發(fā)其他免疫細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子[37],但這一過(guò)程具有自我局限性,因?yàn)樵谥行粤＜?xì)胞密度較高的情況下NETs會(huì)形成聚集體,進(jìn)而降解細(xì)胞因子和趨化因子[38];NETs通過(guò)TLRs激活pDCs,pDCs通過(guò)釋放大量的IFN-Ⅰ,在抗病毒免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39～42]。事實(shí)上,NETs富含被氧化的線粒體DNA,這些物質(zhì)本身就能夠有效地誘導(dǎo)Ⅰ型IFN反應(yīng)[43]。另外,NETs也可以通過(guò)降低T淋巴細(xì)胞的激活閾值來(lái)提高機(jī)體的抗病毒適應(yīng)性免疫[44]。

3 病毒對(duì)NETs的逃避機(jī)制

病毒逃避免疫的機(jī)制十分強(qiáng)大,目前已發(fā)現(xiàn)一些病毒具備對(duì)抗NETs形成的機(jī)制。IL-10是一種免疫抑制細(xì)胞因子,能抑制TLR誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生,其經(jīng)常在病毒感染的背景下產(chǎn)生,這說(shuō)明病毒可能利用IL-10作為一種NETs逃避的手段[45～47]。研究顯示,HIV-1的包膜糖蛋白通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3,結(jié)合非整合素因子(DC-SIGN),刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-10[19]。已有研究發(fā)現(xiàn),包括常見(jiàn)的人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和 EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在內(nèi)的一些大型DNA病毒的基因組能夠編碼產(chǎn)生IL-10的類(lèi)似物,這些IL-10類(lèi)似物分子可抑制免疫細(xì)胞的功能甚至造成細(xì)胞死亡,可能對(duì)NETosis具有抑制效果[48～49]。另有研究報(bào)道,2型登革熱病毒(dengue virus,DENV)可通過(guò)干擾葡萄糖攝取,在ROS非依賴(lài)的晚期階段抑制NETs的形成[50～51]。細(xì)胞因子 IL-8 也是 NETs產(chǎn)生的一個(gè)促進(jìn)因子,而由Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒(kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)編碼的潛伏相關(guān)核抗原1(latency-associated nuclear antigen-1,LANA-1)可以削弱免疫細(xì)胞IL-8的表達(dá)能力,從而抑制NETs的形成[52]。相關(guān)研究早就發(fā)現(xiàn),一些細(xì)菌(如鏈球菌[53])能夠通過(guò)分泌DNase來(lái)降解NETs,皰疹病毒也可以編碼具有相似DNA酶活性的蛋白質(zhì)[54],這些蛋白質(zhì)被包裝到衣殼中,當(dāng)病毒從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái),它們可以降解NETs,從而重新激活被NETs包裹的病毒粒子。

總體來(lái)說(shuō),病毒誘導(dǎo)的NETs通過(guò)直接或間接的機(jī)制減少病毒的擴(kuò)散,而病毒逃避機(jī)制則以NETs的形成為目標(biāo),削弱NETs的抗病毒效應(yīng)和免疫病理反應(yīng)。

4 NETs對(duì)抗病毒過(guò)程中的病理效應(yīng)

NETosis不僅對(duì)病原體具有有效免疫反應(yīng),也可能導(dǎo)致機(jī)體病理反應(yīng),如呼吸困難、自身免疫性疾病和血栓形成,NETs的形成與病原體的感染情況不平衡是導(dǎo)致機(jī)體病理反應(yīng)的主要原因[55]。NETs對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及肝細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性,它們含有的一些抗菌成分(如組蛋白)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和其他病理異常[56～58];NETs的其他成分,如HMGB1,也可能在病毒相關(guān)疾病中發(fā)揮有害作用[59];此外,NETs可以阻塞分泌管道或小氣道,從而導(dǎo)致炎癥[60]。有證據(jù)表明,病毒引起的局部NETs聚集會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫病理反應(yīng)的發(fā)生,目前研究者已在嚴(yán)重RSV感染患兒的支氣管肺泡灌洗液中檢測(cè)到NETs[60];在RSV感染的小牛中,NETs在阻塞小氣道的致密堵塞物中也被檢出[61];在小鼠流感肺炎模型中,研究者在肺泡毛細(xì)血管損傷區(qū)域觀察到了NETs的生成[62]。另一方面,現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明,缺乏肽基精氨酸脫氨酶4(peptidylarginine deiminase 4,PAD4)的小鼠和野生型小鼠一樣,能夠有效地控制流感病毒感染,并顯示出相似的存活率[63],這一結(jié)果表明,NETs在個(gè)體抗病毒免疫和病毒誘導(dǎo)的病理過(guò)程中不起關(guān)鍵作用(PAD4是催化組蛋白H3和H4去亞胺基化的酶,而H3和H4的去亞胺基化對(duì)于NETs的形成是必需的)。當(dāng)然,這些研究的不同結(jié)果也可能是由于不同的實(shí)驗(yàn)中使用了不同的病毒株和小鼠品系。有研究顯示,來(lái)自不同品系小鼠的中性粒細(xì)胞其N(xiāo)ETosis的效率不同[64]。

如果病毒誘導(dǎo)的NETs聚集是一個(gè)重要的致病因素,那么抑制NETs的形成,例如通過(guò)DNA酶降解NETs,就可能消除病毒引起的疾病相關(guān)癥狀。一些臨床試驗(yàn)顯示,用DNA酶治療嬰兒病毒性毛細(xì)支氣管炎后,患兒的臨床癥狀得到改善,但在另一些實(shí)驗(yàn)中沒(méi)得到相同的結(jié)果[65～67]。因此,需進(jìn)一步的研究闡明病毒誘導(dǎo)的肺內(nèi)NETs沉積的確切致病作用,并探索抗NETs治療的有效性。

如果宿主的NETs降解和清除機(jī)制不能有效清除大量出現(xiàn)的NETs,大量的NETs就會(huì)出現(xiàn)在血液循環(huán)中,這將直接和間接地帶來(lái)嚴(yán)重的不良影響。首先,NETs可以直接損傷血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細(xì)胞[55～56];其次,NETs降解產(chǎn)生的一些成分會(huì)成為新的自身抗原并誘導(dǎo)自身抗體,這樣NETs超載會(huì)引發(fā)自身免疫性損傷。事實(shí)上,許多被認(rèn)為是自身免疫性疾病重要靶點(diǎn)的分子(如dsDNA、組蛋白、MPO、波形纖維蛋白和烯醇化酶)都是NETs成分,因此,NETs與小血管血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、彌散性血管內(nèi)凝血、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和子癇前期等系統(tǒng)性自身免疫病的發(fā)生有關(guān)[68～69]。系統(tǒng)性NETs超載可能是由于清除不足或凈產(chǎn)量增加,來(lái)自SLE患者群體的血清研究顯示,DNaseⅠ活性降低,NETs降解減少[70]。除了DNaseⅠ,DNA酶Ⅰ樣蛋白3(DNASE1L3)是另一種可以防止系統(tǒng)性NETs超載的酶,它由樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放,可清除微粒結(jié)構(gòu)中的染色質(zhì)DNA,從而抑制SLE的發(fā)生[71]。有意思的是,在NETs降解酶缺陷的個(gè)體中,即使是具有相對(duì)較弱的NETs刺激能力的病毒,也可以誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[71]。據(jù)此判斷,NETs形成很可能是病毒和系統(tǒng)性自身免疫疾病之間產(chǎn)生聯(lián)系的橋梁。

漢坦病毒屬于布尼亞病毒科,通過(guò)糞口途徑感染人類(lèi),可以導(dǎo)致VHF,患者主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的肺、腎功能不全以及血管內(nèi)凝血和失血性休克。漢坦病毒對(duì)NETosis有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)效果。在DNase活性沒(méi)有明顯減弱的情況下,漢坦病毒感染可以通過(guò)誘導(dǎo)NETs的過(guò)量形成引起暫時(shí)性、系統(tǒng)性NETs超載。漢坦病毒在內(nèi)皮細(xì)胞(其主要靶細(xì)胞)中復(fù)制,在體外實(shí)驗(yàn)中不會(huì)直接造成程序性細(xì)胞死亡,這表明漢坦病毒造成的病理?yè)p傷可能并不是由漢坦病毒直接造成的,而是由漢坦病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)所致,其中就包括NETs引起的免疫病理反應(yīng)[72～73]。在漢坦病毒感染的患者中,人們檢測(cè)到高水平的NETs,在其血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了大量的游離DNA和組蛋白[72],說(shuō)明NETs的細(xì)胞毒活性可能在漢坦病毒所致病理?yè)p傷中起著重要的作用。已有研究證明,組蛋白可以促進(jìn)凝血酶的生成和血管內(nèi)凝血,并能增強(qiáng)內(nèi)皮屏障的通透性[74～75]。此外,NETs還可以誘導(dǎo)自身抗體的形成,這也可能是漢坦病毒所致病理反應(yīng)的機(jī)制之一。

登革熱病毒(DENV)通過(guò)伊蚊在人與人之間傳播,是引起VHF的另一種致命病毒。目前,DENV顆粒在體外實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有顯示出強(qiáng)烈的NETs誘導(dǎo)效果[50]。然而,體內(nèi)感染DENV的細(xì)胞可通過(guò)分泌病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)間接刺激NETosis,NS1通過(guò)TLR4途徑激活未受感染的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板[76]?；罨膬?nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放IL-8促使中性粒細(xì)胞進(jìn)入NETosis,研究顯示,DENV患者體內(nèi)存在高水平的IL-8和彈性蛋白酶(NETs的一個(gè)關(guān)鍵組成部分),并且其水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[77];另外,活化的血小板也能刺激中性粒細(xì)胞進(jìn)行NETosis。這些病理效應(yīng)說(shuō)明,病毒引起的NETs對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)可能是一把雙刃劍[12]。一方面,精準(zhǔn)聚集在感染區(qū)域的NETs,可以固定甚至中和病毒并殺死病毒感染的細(xì)胞;另一方面,如果NETs降解機(jī)制(主要依賴(lài)DNase活性)受損,或者病毒刺激NETs的能力太強(qiáng),NETs導(dǎo)致的病理反應(yīng)可能會(huì)擴(kuò)散并引起健康組織損傷,甚至導(dǎo)致全身系統(tǒng)性病理反應(yīng),在這種NETs超載的情況下,自身免疫現(xiàn)象將被觸發(fā),可能導(dǎo)致全身疾病。

5 結(jié)束語(yǔ)與展望

現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)研究表明,細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)以及病毒中的大部分病原微生物都能刺激中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis。相對(duì)于細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng),雖然病毒的體積相對(duì)微小,但它仍然會(huì)被NETs捕獲,這些被捕獲的病毒會(huì)被NETs包裹纏繞,減少擴(kuò)散。不過(guò),NETs是否能完全將入侵的病毒殺死,依病毒種類(lèi)的不同效果不盡一致,具體還需要進(jìn)一步探討。相對(duì)于NETs的益處,過(guò)多NETs產(chǎn)生也會(huì)造成局部甚至全身系統(tǒng)的病理反應(yīng),對(duì)機(jī)體造成重大的損傷,因此,深入探索病毒感染情況下NETs的形成機(jī)制將是未來(lái)NETs研究的重要方向,這對(duì)于我們控制NETs的生成,減輕其帶來(lái)的“副作用”,將NETs的作用發(fā)揮到恰到好處具有重要的意義。