分子印跡摻雜金屬有機框架固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法 測定大米中10種磺酰脲類除草劑

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(1.河北北方學院,河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室,河北張家口 075000; 2.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,農業(yè)部農產品質量安全重點實驗室,北京 100081)

磺酰脲類除草劑(Sulfonylurea herbicide)的結構通式為芳香基、磺酰脲橋和雜環(huán)三部分,主要用于水稻、大豆、玉米、油菜等的雜草防治,是目前世界各國應用范圍最廣、用量最大的除草劑之一[1-2]?；酋ｋ孱惓輨┧苄詷O強,易進入土壤并造成水體污染,不僅影響農作物、藻類及魚類的繁殖和發(fā)育,還可通過食物鏈富集傳遞對人體健康造成危害[3]。因此,中國、美國、日本、歐盟等多個國家和地區(qū)均針對不同農產品規(guī)定了磺酰脲類除草劑的殘留限量[4]。

目前,磺酰脲類除草劑的主要檢測方法有酶聯免疫法(ELISA)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、毛細管電泳法(CE)[7]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[8-9]等。測定的樣品主要涉及糧谷、土壤和水等基質。近年來,液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)以其靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點,成為了磺酰脲類除草劑的主要檢測手段,但其前處理步驟存在操作繁瑣,基質干擾嚴重,檢測藥劑種類單一等缺點,急需研發(fā)類特異性吸附效果好、富集能力強、簡便快速的新型固相萃取材料。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)是由分子印跡技術(Molecularly imprinted technique,MIT)合成的一種兼具特異性識別和富集能力的高分子材料[10]。以其作為填料的分子印跡固相萃取技術(MISPE)極大地降低了基質干擾,提高了檢測的靈敏度和準確性。鄭亞麗等[11]和Tang等[12]分別建立了分子印跡固相萃取與高效液相色譜聯用測定煙葉和大米中磺酰脲類除草劑的檢測技術。金屬有機框架(Metal organic frameworks,MOFs)是一種以金屬離子為中心,通過配位鍵與有機配體自組裝形成的多孔網狀材料[13-14]。MOFs材料因其具有架構與功能多樣性、比表面積和孔隙率較大、孔徑大小可調控、生物兼容性強等優(yōu)點[15-16],在氣體吸附存儲、傳感器、藥物緩釋等領域應用廣泛,近年來也被拓展應用于農藥殘留[17-18]、重金屬[19-20]、多環(huán)芳烴[21]等食品有害物質的痕量分析前處理中。

本研究集磺酰脲類除草劑MIP與MOFs材料的優(yōu)勢,以MOFs-MIP為復合吸附劑的固相萃取法對樣品進行分離、凈化和富集,極大提高了前處理步驟的選擇性和效率,結合HPLC-MS/MS法實現了對大米中10種磺酰脲類除草劑的高通量、快速痕量檢測,為大米等糧谷類農產品中磺酰脲類除草劑殘留的監(jiān)管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10種磺酰脲類除草劑(甲磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆、單嘧磺隆、噻吩磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、煙嘧磺隆、芐嘧磺隆、吡嘧磺隆)標準品 色譜純,德國Dr. Ehrerstorfer公司;甲磺隆、4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 分析純,北京百靈威科技有限公司;2-甲基咪唑、六水合硝酸鋅 分析純,美國Sigma公司;甲醇、乙腈、甲酸 色譜純,德國 Merck公司;大米 某超市。

Waters 2695型高效液相色譜儀、Waters 2998型二極管陣列檢測器、Waters X Bridge C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm) 美國Waters公司;Agilent 1200型液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm) 美國Agilent公司;API 5000型串聯四級桿質譜儀 美國AB SCIEX公司;SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海旌派儀器有限公司;Thermo Fisher ST8 ST8R臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;SU8020 掃描電子顯微鏡 日本 Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磺酰脲類除草劑MIP的制備 以甲磺隆為模板分子,4-乙烯吡啶(4-VP)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯劑,按照摩爾質量1∶4∶20的比例,以乙腈作為溶劑構建分子印跡聚合體系,參考Bastide等[22]的沉淀聚合法制備MIP。非印跡聚合物(NIP)的制備過程除不加入模板分子外,其他步驟同上。采用掃描電鏡(SEM)對合成的MIP和NIP進行表征分析。

1.2.2 MOFs材料的制備 采用液相擴散法制備MOFs材料中的沸石咪唑骨架(ZIF-8)[23]。稱取六水合硝酸鋅1.8 g,2-甲基咪唑3.9 g,分別加入50 mL離心管中,各加入30 mL乙腈常溫下500 W超聲5 min至其充分混勻,將上述兩溶液轉移至錐形瓶中混合,常溫下攪拌30 min,所得混合物經乙醇洗滌7次,60 ℃下烘干24 h至充分干燥待用。采用SEM對合成材料進行表征分析。

表1 10種磺酰脲類除草劑質譜分析參數Table 1 Mass spectrometry parameters for analysis of 10 kinds of sulfonylurea herbicides

注:*:定量離子(Quantitative ion)。

1.2.3 MOFs-MIP固相萃取方法的優(yōu)化 采用干法裝柱法制備固相萃取柱。分別稱取40 mg MIP與10 mg MOFs材料渦旋振蕩混勻。預先在空柱內裝入第一片20 μm孔徑的篩板,再將上述復合填料移入小柱中加蓋第二片篩板,并用玻璃棒以適當力度推動第二片篩板壓緊填料,制成MOFs-MIP固相萃取柱。以甲磺隆、吡嘧磺隆作為代表性目標物,結合兩種填料的解吸特性,通過測定其回收率優(yōu)化該復合SPE柱的活化、上樣、淋洗及洗脫條件。

1.2.4 高效液相色譜分析條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(100×2.1 mm,3.5 μm);柱溫:25 ℃;進樣體積:5 μL;流速:300 μL/min。流動相A:0.1%甲酸水,流動相B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫程序:0～2 min,10%～40% B;2～6 min,40%～60% B;6～12 min,60%～90% B;12～15 min,90% B;15～15.1 min,90%～10% B;15.1～21 min,10% B。

1.2.5 質譜分析條件 多重反應監(jiān)測(MRM)模式;電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式;噴霧電壓(IS+):5500 V;離子源溫度(TEM):450 ℃;氣簾氣(CUR):15 psi,霧化氣壓力(GS1):14 psi,加熱輔助氣壓力(GS2):20 psi。10種磺酰脲類除草劑質譜分析參數見表1。

1.2.6 大米實際樣品檢測 準確稱取10 g粉碎后過830 μm篩的大米樣品于50 mL離心管中,加入10種磺酰脲類除草劑混合標準品,再加入5 mL超純水,渦旋30 s;加入10 mL乙腈,渦旋30 s;加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂,渦旋2 min,5000 r/min離心5 min。取1 mL上清液,緩慢氮吹至干并加入1 mL乙腈復溶,過0.22 μm有機濾膜,待凈化。

MOFs-MIP固相萃取柱依次用5 mL乙腈和5 mL超純水活化。取5 mL待凈化液上樣后,用3 mL超純水淋洗并抽干。依次加入10 mL乙酸-甲醇溶液(1∶9,V/V)和5 mL丙酮洗脫,合并洗脫液在45 ℃下氮氣吹干。殘渣加入1 mL乙腈復溶,過0.22 μm有機濾膜,裝入樣品瓶中進行HPLC-MS/MS測定。

1.3 數據處理

利用Microsoft Office Excel 2010版對數據進行分析,使用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 磺酰脲類除草劑MIP的表征分析

采用掃描電鏡對制備的磺酰脲類除草劑MIP與NIP的表面形態(tài)進行表征,可知MIP(圖1a)微球結構清晰完整,大小均一(直徑為1 μm左右),表面具有明顯的褶皺狀結構,揭示其可能有更大的比表面積和更多的識別位點。而NIP(圖1b)結構之間交聯緊密,表面較為平滑,無明顯特征結構。

圖1 磺酰脲類除草劑(a)MIP 和(b)NIP掃描電鏡圖(50000×)Fig.1 SEM images of the prepared sulfonylurea herbicide(a)MIP and(b)NIP(50000×)

2.2 MOFs的掃描電鏡表征分析

本試驗中所制備的MOFs材料為ZIFs 系列中的ZIF-8。ZIFs是一類具有沸石骨架結構的MOFs材料,是由過渡金屬離子Zn2+和Co2+等通過咪唑或功能化咪唑連接而成的四面體簇,ZIF-8是該系列中的典型代表。圖2是不同倍率下ZIF-8的掃描電鏡圖,其形貌較均一,微粒外形具有明顯的棱角,平均粒徑為500 nm左右,整體呈現聚合堆積狀態(tài),有機配體和金屬離子的排列具有明顯的方向性,具有超高的比表面積和孔隙率,與Han等[24]的結果一致。

圖2 MOFs材料掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of the prepared MOFs注:a:放大倍數為100000倍;b:放大倍數為50000倍。

2.3 MOFs-MIP固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 活化液的選擇 固相萃取的活化液分別受到MIP的識別環(huán)境及MOFs材料的吸附條件等因素的影響。由預試驗可知本研究中制備的MIP在純乙腈溶劑條件下可實現對目標物的類特異性吸附,而MOFs材料具有良好的親水性,在水相比例較高的溶劑中對目標物吸附性較好。因此,本試驗考察了5 mL乙腈、5 mL乙腈+5 mL水、5 mL乙腈-二氯甲烷(1∶1,V/V)三種活化液對固相萃取柱的活化效果。如圖3所示,采用乙腈-水作為活化液對甲磺隆和吡嘧磺隆兩種除草劑均有良好的吸附回收(平均回收率分別為98.6%、94.8%)。因此本試驗選擇乙腈-水作為活化液。

圖3 不同活化液對磺酰脲類除草劑回收率的影響Fig.3 Effects of different activators on recoveries of sulfonylurea herbicides

2.3.2 上樣液的選擇 本試驗選取不同比例的乙腈水溶液(100%乙腈、95%乙腈、90%乙腈、80%乙腈)作為上樣液,考察了甲磺隆和吡嘧磺隆在SPE柱上的保留效果。如圖4所示,各上樣液對甲磺隆的回收率無明顯影響,采用純乙腈溶劑為上樣液時吡嘧磺隆在SPE柱上幾乎無保留,而隨著上樣液中水相比例的逐漸增加,吡嘧磺隆的回收率明顯上升,因此本試驗選擇80%乙腈作為上樣液。

圖4 不同上樣液對磺酰脲類除草劑回收率的影響Fig.4 Effects of different loading solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides

圖5 不同淋洗液對磺酰脲類除草劑回收率的影響Fig.5 Effects of different washing solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides

2.3.3 淋洗液的選擇 淋洗劑的選擇是影響固相萃取柱回收率的重要因素,它不僅能去除非特異性結合的雜質,而且還能最大程度地保留目標化合物,從而提高檢測的準確性和靈敏度。本試驗考察了乙腈、甲醇、正己烷、水、80%乙腈、80%甲醇六種淋洗液的淋洗效果。如圖5所示,用水作為淋洗液時兩種除草劑均達到了最大平均回收率(98.3%,97.3%),而乙腈、甲醇對MOFs材料具有一定的解吸作用,影響了回收效果。因此本試驗選擇水作為淋洗液。

2.3.4 洗脫液的選擇 洗脫液的選擇需綜合考慮兩種材料的解吸特性,

圖6 洗脫液對磺酰脲類除草劑回收率的影響Fig.6 Effects of different elution solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides注:1:10 mL乙腈;2:10 mL 甲醇;3:10 mL丙酮; 4:10 mL乙腈+5 mL丙酮先后洗脫; 5:10 mL甲醇+5 mL丙酮先后洗脫; 6:10 mL乙酸-甲醇(1∶9，V∶V)+5 mL丙酮先后洗脫。

本試驗考察了10 mL乙腈、10 mL甲醇、10 mL丙酮、10 mL乙腈與5 mL丙酮先后洗脫、10 mL甲醇與5 mL丙酮先后洗脫、10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V∶V)與5 mL丙酮先后洗脫六種洗脫模式的洗脫效果。如圖6所示,采用10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V∶V)與5 mL丙酮先后洗脫的方式可實現兩種除草劑的最大平均回收率(96.2%,95.7%)。因此本試驗選擇10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V/V)與5 mL丙酮先后洗脫作為洗脫方式。

2.4 填料組分配比的優(yōu)化

為了考察不同填料組分配比對磺酰脲類除草劑的類特異性吸附效果,本試驗將40 mg MIP分別與5、10、20 mg MOFs材料混合,按照2.3的優(yōu)化固相萃取條件(5 mL乙腈+5 mL水為活化液,80%乙腈-水為上樣液,3 mL水淋洗,10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V/V)與5 mL丙酮先后洗脫),對10種磺酰脲類除草劑進行富集測定,標準溶液濃度為5 μg/mL。由表2可知,除氯磺隆外,MOFs材料為10 mg 時的回收率均大于其為5 mg 時的回收率,MOFs材料為10 mg與20 mg時的回收率非常接近,且均可滿足檢測需要。從材料經濟角度考慮最終選取40 mg MIP與10 mg MOFs材料混合作為SPE柱填料配比。

2.5 SPE柱的重復利用性

本試驗考察了3根MOFs-MIP SPE柱的重復利用效果,用上樣液配制1 μg/mL的10種磺酰脲類除草劑混合標準溶液,在2.3的優(yōu)化固相萃取條件下反復多次平行測定。結果由表3、表4、表5可知,SPE柱在重復利用10次后除氟胺磺隆、煙嘧磺隆、吡嘧磺隆的平均回收率下降到69%、74%、69%外,其余除草劑的回收率依然保持在80%～95%之間,表明該SPE柱具有良好的重復利用性。

表3 平行測試1Table 3 Parallel experiment 1

表4 平行測試2Table 4 Parallel experiment 2

表2 不同填料組分配比固相萃取檢測 10種磺酰脲類除草劑的回收率Table 2 Recoveries of 10 kinds of sulfonylurea herbicides detected by SPE cartridge with different component proportions of fillers

2.6 方法學評價及大米樣品測定

用大米空白樣品基質配制成1、2、5、10、20、50、100 μg/kg系列濃度梯度的10種磺酰脲類除草劑混合標準溶液,10種磺酰脲農藥總離子色譜圖如圖7所示,在1.2.4和1.2.5的儀器分析條件下進行測定并繪制標準曲線,10種磺酰脲農藥的標準線性方程和相關系數r如表6所示。結果表明,標準曲線在1～100 μg/kg范圍內呈現良好的線性關系,相關系數(r)均大于0.991,初步表明在此范圍內可進行定量分析。取定量離子信噪比S/N=3對應的濃度為樣品的檢出限(LOD),S/N=10對應的濃度為樣品的定量限(LOQ),方法LOD和LOQ分別在0.07～0.50和0.23～1.70 μg/kg之間。測得的噻吩磺隆的LOD為0.07 μg/kg,單嘧磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆的LOD為0.2 μg/kg,氟胺磺隆、芐嘧磺隆、吡嘧磺隆的LOD為0.4 μg/kg,甲磺隆、氯磺隆、氟磺隆LOD為0.5 μg/kg,均低于劉慧慧等[8]用MAX 固相萃取柱凈化水產品樣品測得的磺酰脲類除草劑的檢出限(1 μg/kg),也低于湯凱潔等[25]用芐嘧磺隆分子印跡固相萃取柱測定的大米中煙嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆和芐嘧磺隆的回收率(1.14、1.17、1.29、2.85 μg/kg),表明該SPE柱相比傳統(tǒng)的固相萃取柱及分子印跡固相萃取柱,具有更好的檢測靈敏度。

表5 平行測試3Table 5 Parallel experiment 3

表6 10種磺酰脲農藥的標準線性方程和相關系數rTable 6 Standard linear equations and relative coefficients(r)of 10 sulfonylurea herbicides

注:Y:峰面積;X:質量濃度,μg/kg。

圖7 10種磺酰脲農藥總離子色譜圖(10 ng/mL)Fig.7 Total ion chromatogram of 10 sulfonylurea herbicides(10 ng/mL)注:1:單嘧磺隆;2:噻吩磺隆;3:甲磺隆;4:氯磺隆; 5:煙嘧磺隆;6:芐嘧磺隆;7:氟黃隆; 8:吡嘧磺隆;9:氟胺磺隆;10:氯嘧磺隆。

基于《GB 2763-2016食品中農藥最大殘留限量》[4]規(guī)定的有關糧谷中磺酰脲類除草劑的MRL值及本方法的靈敏度,設定大米樣品中的添加水平為10、20和50 μg/kg,每個水平3次重復,添加回收率與相對標準偏差如表7所示。10種磺酰脲類除草劑的平均回收率在79.75%～99.05%之間,相對標準偏差為6.7%～13.8%,滿足分析方法的要求。

表7 10種磺酰脲類除草劑在大米中的添加回收結果(n=3)Table 7 Recoveries of 10 kinds of sulfonylurea herbicides in rice samples(n=3)

3 結論

本試驗將制備的磺酰脲類除草劑按40 mg MIP與10 mg MOFs混合,以其為填料制成MOFs-MIP固相萃取柱,結合HPLC-MS/MS方法,實現了大米中10種磺酰脲類除草劑的同步快速痕量分析。本研究將MIP和MOFs材料在固相萃取中聯用,彌補了傳統(tǒng)MIP形狀不規(guī)則,模板滲漏及MOFs材料選擇性差的不足,為大米、糧谷等復雜基質中磺酰脲類除草劑的多殘留檢測提供了技術支撐。