Doehlert設(shè)計(jì)法結(jié)合渴求函數(shù)優(yōu)化黨參中多成分的提取工藝

(張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院,甘肅張掖 734000)

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch). Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根,主要含有糖類、苷類、甾體類、氨基酸類、揮發(fā)油、三萜類、倍半萜內(nèi)酯類等成分[1-4],具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效[5]。2018年中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的征求意見稿中黨參被收錄[6],進(jìn)一步擴(kuò)大了黨參作為一種天然保健植物的應(yīng)用范圍。為更好的拓寬發(fā)展黨參價(jià)值,建立一種對(duì)其多成分同時(shí)具有較好提取效果的方法尤為必要。

目前,國內(nèi)在提取工藝優(yōu)化時(shí)常采用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7-9]。其大部分選擇采用Central Composite Design(CCD)設(shè)計(jì)或Box-Benhnken Design(BBD)設(shè)計(jì)[10-12],這兩種模型試驗(yàn)數(shù)多,且對(duì)不同影響因素不能采用不同的試驗(yàn)數(shù),對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求較高。Doehlert設(shè)計(jì)是近年流行的一種新的設(shè)計(jì)方式,與其他設(shè)計(jì)方法,如CCD設(shè)計(jì)和BBD設(shè)計(jì)方法相比,具有試驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較少、效率高的特點(diǎn)。4因素試驗(yàn)Doehlert設(shè)計(jì)僅需21組試驗(yàn),CCD設(shè)計(jì)和BBD設(shè)計(jì)則需要至少25組試驗(yàn)[13]。同時(shí)Doehlert設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)采用即相鄰的正六邊型的空間排列[14],各因素的水平數(shù)設(shè)置不同,可以根據(jù)這種性質(zhì)自由選擇所考察因子設(shè)計(jì)的水平數(shù),將有顯著影響的因子水平數(shù)設(shè)置較多數(shù)目,從而使設(shè)計(jì)更能反映試驗(yàn)本身實(shí)際情況。同時(shí)結(jié)合渴求函數(shù)可以多重響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行整體分析,找到最佳工藝條件[15],具有更加實(shí)用的意義。

關(guān)于黨參可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物的單獨(dú)提取工藝優(yōu)化已有報(bào)道[16-20],上述成分同時(shí)提取的工藝條件建立及優(yōu)化未見報(bào)道。本文嘗試采用Doehlert設(shè)計(jì)法結(jié)合渴求函數(shù),以料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率為考察因素,以黨參中可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物的含量為考察指標(biāo),通過整體渴求函數(shù)確定以上4種成分同時(shí)提取的最佳工藝條件,為黨參進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔?？浦参稂h參飲片Codonopsispilosula(Franch). Nannf. 張掖德生堂藥店;黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào):18127904,純度98%)、紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào):17112804,純度98%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;果糖、D-葡萄糖、蔗糖 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇(分析純)、甲醇(分析純，色譜純) 成都市科隆化學(xué)品有限公司;純凈水 華潤怡寶飲料中國有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀(包括SPD-M20A二極管陣列檢測器,ELSD-LT II蒸發(fā)光散射檢測器)、InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 日本島津公司;KH-250DB數(shù)控超聲波提取器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;CP225D十萬分之一電子天平、BS224S萬分之一電子天平 賽多利斯上海貿(mào)易有限公司;ML503/02千分之一電子天平 梅特勒-托利多國際上海貿(mào)易有限公司;HH恒溫水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠;Venusil HILIC親水作用色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黨參炔苷與紫丁香苷的含量測定

1.2.1.1 黨參炔苷與紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.64 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成425.6 μg/mL的紫丁香苷儲(chǔ)備溶液;精密稱取黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.20 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成204.0 μg/mL的黨參炔苷儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取紫丁香苷儲(chǔ)備溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 mL,黨參炔苷儲(chǔ)備溶液1.00、2.00、4.00、5.00、7.00 mL于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,制成每1 mL分別含紫丁香苷4.3、21.3、42.6、85.1、127.7 μg,含黨參炔苷20.4、40.8、81.6、102.0、142.8 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。采用C18色譜柱,流動(dòng)相A為甲醇,B為0.08%磷酸溶液,洗脫方式:梯度洗脫,0～10 min,6%甲醇,10～30 min,6%甲醇～14%甲醇,30～40 min,14%～24%甲醇,40～55 min,24%甲醇,55～61 min,6%甲醇,柱溫:35 ℃,采用二極管陣列檢測器,檢測波長:267 nm,流速:1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)(A),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 取黨參藥材粉末約1 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,按最優(yōu)提取工藝提取后,放冷,過濾,濾液水浴蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,既得測試樣品,按“1.2.1.1”色譜條件測定。

1.2.2 可溶性糖的測定

1.2.2.1 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取果糖268.2 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.73 mg/mL的果糖儲(chǔ)備溶液;精密稱取葡萄糖253.3 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.13 mg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備溶液;精密稱取蔗糖264.4 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.58 mg/mL的蔗糖儲(chǔ)備溶液。分別精密吸果糖儲(chǔ)備溶液1.00、2.00、3.00、3.50、4.00 mL,葡萄糖儲(chǔ)備溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL,蔗糖儲(chǔ)備溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL量瓶中,加10%甲醇至刻度,搖勻,制成每1 mL分別含果糖1.1、2.2、3.2、3.8、4.3 mg,葡萄糖1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg,蔗糖1.1、1.6、2.1、2.6、3.2 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。采用HILIC親水作用色譜柱,流動(dòng)相參考文獻(xiàn)[21]后經(jīng)預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證,確定為A為乙腈,B為水,洗脫方式:等度洗脫,15%乙腈-水為流動(dòng)相,柱溫:35 ℃,采用蒸發(fā)光檢測器,漂移管溫度40 ℃,流速:1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,可溶性糖以果糖、葡萄糖、蔗糖三種糖總量計(jì)。因D-葡萄糖在常溫溶液中,會(huì)發(fā)生異構(gòu)化現(xiàn)象,實(shí)際存在α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖兩種異構(gòu)體[22-23],產(chǎn)生2個(gè)色譜峰,比例相對(duì)穩(wěn)定在36∶64,故在分析中以α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖峰總面積作為葡萄糖的計(jì)算依據(jù)。以峰面積以10為底對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Alog),對(duì)照品濃度以10為底對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(Clog)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取黨參藥材粉末約1 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,按最優(yōu)提取工藝提取后,放冷,濾過,濾液置100 mL量瓶中,用少量提取溶劑分次洗滌容器,濾液濾入同一量瓶中,加溶劑至刻度,搖勻,既得測試樣品,按“1.2.2.1”所述色譜條件測定。

1.2.3 浸出物的測量 參照《中國藥典》2015年版四部2201浸出物測定法項(xiàng)下“熱浸法”[24],精密量取按最優(yōu)提取工藝提取定容后溶液45 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 提取工藝的優(yōu)化 Doehlert設(shè)計(jì)是由考察的因子-水平數(shù)目及其設(shè)計(jì)矩陣編碼值來定義的[25-26],真實(shí)值和編碼值的關(guān)系見下式(1):

式(1)

Doehlert設(shè)計(jì)所需試驗(yàn)次數(shù)N可用公式N=k2+k+C0表示,其中k為所考察因素的數(shù)目,C0表示中心點(diǎn)的數(shù)目,該數(shù)目用來評(píng)價(jià)模型的試驗(yàn)誤差。結(jié)合其他文獻(xiàn)中對(duì)于單一成分的提取方法優(yōu)化的結(jié)果[16-20],綜合考慮所涉及的影響因素,確定該試驗(yàn)考察料液比(1∶15～1∶75)、提取時(shí)間(10～130 min)、乙醇濃度(28%～100%)、超聲功率(180～300 W)4個(gè)因素,按照式(1)方程計(jì)算編碼值。Doehlert設(shè)計(jì)矩陣選擇的各水平數(shù)及對(duì)應(yīng)的編碼值見表1。

1.3 多重響應(yīng)的數(shù)據(jù)處理

渴求函數(shù)法是將每個(gè)響應(yīng)值Yi轉(zhuǎn)化為滿意度函數(shù)di,di∈[0,1]。響應(yīng)越接近目標(biāo)值,其滿意度越接近1,響應(yīng)越接近規(guī)格限或超出規(guī)格限,滿意度就越接近0或等于0[27-28]。

取值越大越好的響應(yīng),研究人員可以選定一個(gè)下界值y-和一個(gè)上界值y+,當(dāng)響應(yīng)值Yi≤y-時(shí),di=0,認(rèn)為結(jié)果不可接受;響應(yīng)值Yi≥y+,di=1,認(rèn)為結(jié)果是最接近最佳狀況的;響應(yīng)值Yi介于y+和y-之間時(shí),di按公式(2)進(jìn)行計(jì)算,其中r用來調(diào)整渴求函數(shù)的形狀。

式(2)

取值越小越好的響應(yīng),研究人員可以選定一個(gè)下界值y-和一個(gè)上界值y+,當(dāng)響應(yīng)值Yi≤y-時(shí),di=1,認(rèn)為結(jié)果是最接近最佳狀況的;響應(yīng)值Yi≥y+,di=0,認(rèn)為結(jié)果是不可接受;響應(yīng)值Yi介于y+和y-之間時(shí),di按公式(3)進(jìn)行計(jì)算,其中r用來調(diào)整渴求函數(shù)的形狀。

式(3)

整體渴求函數(shù)D:假定某優(yōu)化過程有m個(gè)響應(yīng),第i次響應(yīng)已經(jīng)選定了一個(gè)渴求函數(shù)di,其中i=1,…m,則整體渴求函數(shù)D可定義為di的加權(quán)幾何平均數(shù)。

式(4)

從公式(4)可得,若任意一個(gè)di=0,則D=0,整個(gè)過程不可被接受。能使D值最大化的因子水平即為最優(yōu)化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參炔苷與紫丁香苷色譜分離

按“1.2.1”項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,并按相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果如圖1,分離效果良好,說明該色譜條件滿足對(duì)樣品的測量要求。紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:A=1976.85C-3196.06,R2=0.9963;黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:A=11347.2C-18002.6,R2=0.9986。表明紫丁香苷濃度在4.3～127.7 μg/mL范圍內(nèi)、黨參炔苷濃度在20.4～142.8 μg/mL范圍內(nèi)響應(yīng)值與其含量線性良好,可以滿足對(duì)樣品黨參炔苷與紫丁香苷的定量測量的需求。

圖1 對(duì)照品(A)與黨參樣品(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.紫丁香苷;2.黨參炔苷。

2.2 可溶性糖的色譜分離

按“1.2.2”項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,并按相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果如圖2,分離效果良好,說明該色譜條件滿足對(duì)樣品的測量要求。果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Alg=0.7657Clg-4.6882,R2=0.9973;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Alg=0.6981Clg-4.2127,R2=0.9976;蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Alg=0.7452Clg-4.5575,R2=0.9978,表明果糖濃度在1.1～4.3 mg/mL范圍內(nèi)、葡萄糖濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內(nèi)、蔗糖濃度在1.1～3.2 mg/mL范圍內(nèi)響應(yīng)值與其含量線性良好,可以滿足對(duì)樣品可溶性糖定量測量的需求。

表1 Doehlert設(shè)計(jì)矩陣及其編碼值Table 1 Doehlert matrix and its coded values for variables

注:括號(hào)里的數(shù)字為真實(shí)值。

圖2 對(duì)照品(A)與黨參樣品(B)色譜圖Fig.2 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.果糖;2.α-D-葡萄糖;3.β-D-葡萄糖;4.蔗糖。

2.3 響應(yīng)曲面的優(yōu)化

2.3.1 多重線性回歸 響應(yīng)曲面是通過建立響應(yīng)值(因變量)與被考察因素(自變量)的函數(shù)關(guān)系,找到在響應(yīng)值最大時(shí),自變量的取值范圍即最佳試驗(yàn)條件的方法[29-30]。本次試驗(yàn)為4因素試驗(yàn),待擬合方程為:

式(5)

式中,Yi為響應(yīng)值;X1～X4為考察因素;β0～β14為相關(guān)系數(shù),分別表達(dá)了被考察因素的線性效應(yīng),二次效應(yīng)和交互效應(yīng)。

按“1.2.4”項(xiàng)下表1 Doehlert設(shè)計(jì)矩陣進(jìn)行試驗(yàn),將分析得到的果糖,葡萄糖,蔗糖含量進(jìn)行加和作為可溶性糖(Y1),與紫丁香苷(Y2)、黨參炔苷(Y3)、浸出物(Y4)的含量作為分析結(jié)果,通過SAS 8.0進(jìn)行多元線性回歸擬合,通過方差分析判斷模型優(yōu)劣,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),其中pY1、pY2、pY3、pY4為各響應(yīng)值預(yù)測值。結(jié)果如表2。

多元線性回歸方程:

表2 響應(yīng)值實(shí)測值與其預(yù)測值Table 2 Obtained and predicted values of responses

表3 各因素渴求值及整體渴求值Table 3 Desirability value of each factor and overall desirability value

圖3 交互作用響應(yīng)面Fig.3 Response surface plots of interactions注:a～f分別表示X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4因素交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)

多元線性回歸方程:

式(6)

2.3.2 響應(yīng)曲面及其等高線 根據(jù)模型的回歸方程(6),選取交互關(guān)系顯著的因素,分別對(duì)其中2個(gè)變量取中值,代入回歸方程(6),應(yīng)用Origin 6.0軟件繪制D與其他2個(gè)自變量的響應(yīng)曲面及其等高線圖,結(jié)果如圖3。

通過上圖可以直觀觀察到兩個(gè)變量之間的交互作用,從響應(yīng)曲面及其等高線圖的形狀上可以看出兩個(gè)變量間的交互作用的強(qiáng)弱,最佳優(yōu)化劑量條件為曲面頂點(diǎn)附近的區(qū)域?？梢钥闯?料液比、提取時(shí)間與超聲功率間存在明顯的相關(guān)性,原因可能是因?yàn)槌曁崛≈刑崛∪軇w積對(duì)超聲的傳導(dǎo)有影響,合適的料液比及超聲時(shí)間,有助于對(duì)目標(biāo)成分的提取;乙醇濃度對(duì)于提取率有較為顯著的影響,與料液比存在明顯的交互關(guān)系,與其他因素則交互作用不明顯,原因可能是因?yàn)橐掖剂康脑黾訉?duì)于目標(biāo)成分的溶解性增強(qiáng),但過高的乙醇濃度會(huì)造成樣品中多糖的析出,影響整個(gè)提取過程。應(yīng)用LINGO 9.0對(duì)整體渴求值D回歸方程進(jìn)行計(jì)算,得到相應(yīng)的自變量最佳取值,得到預(yù)測最佳提取結(jié)果:料液比1∶60,提取時(shí)間70 min,乙醇濃度64%,超聲功率240 W。該工藝下提取,預(yù)測可溶性糖含量469.51 mg/g,紫丁香苷含量92.32 μg/g,黨參炔苷含量332.77 μg/g,浸出物含量69.10%,預(yù)測整體渴求值pD為1。結(jié)合實(shí)際操作的便捷性,確定最佳提取條件:料液比1∶60,提取時(shí)間80 min,乙醇濃度70%,超聲功率250 W。

表5 優(yōu)化工藝驗(yàn)證(n=3)Table 5 Validation of optimized process(n=3)

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證

根據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下最優(yōu)提取條件,對(duì)黨參進(jìn)行提取,得到各成分含量實(shí)測值,并求出實(shí)測整體渴求值D,并與預(yù)測值pD進(jìn)行比較,由偏差的絕對(duì)值大小來判斷擬合方程是否能夠較好的描述因素與各成分含量的關(guān)系,結(jié)果如表5。4種目標(biāo)成分提取率預(yù)測值和實(shí)測值較為接近,各成分實(shí)測渴求值d均在0.85以上,實(shí)測整體渴求函數(shù)D=0.91,與預(yù)測整體渴求值pD偏差9.0%,實(shí)測值與預(yù)測值偏差較小。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Doehlert設(shè)計(jì)結(jié)合渴求函數(shù)響應(yīng)曲面優(yōu)化法,以多個(gè)變量為指標(biāo),同時(shí)對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,考察了料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率4個(gè)因素對(duì)黨參中可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物提取效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果通過渴求函數(shù)處理后,采用多元回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,再根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)曲面及其等高線圖,并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算,得到最佳工藝:料液比1∶60,提取時(shí)間70 min,乙醇濃度64%,超聲功率240 W,預(yù)測整體渴求值pD為1。結(jié)合實(shí)際操作的便捷性,實(shí)際操作采用:料液比1∶60,提取時(shí)間80 min,乙醇濃度70%,超聲功率250 W,該工藝下提取,實(shí)測可溶性糖含量434.14 mg/g,紫丁香苷含量86.37 μg/g,黨參炔苷含量287.94 μg/g,浸出物含量65.11%,實(shí)測整體渴求值D為0.91,實(shí)測值與預(yù)測值偏差較小。說明模型預(yù)測性良好,通過整體渴求函數(shù)確定以上4種成分同時(shí)提取的最佳工藝條件可行,可以為進(jìn)一步開發(fā)黨參價(jià)值,拓寬黨參應(yīng)用范圍和相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的提供一定的基礎(chǔ)。