發(fā)酵對(duì)黃精主要活性成分及其抗氧化活性和刺激性的影響

楊婧娟,張 希,馬雅鴿,楊 薇,陳 偉,杜雯霞,趙聲蘭

(云南中醫(yī)藥大學(xué),云南昆明 650500)

黃精為百合科黃精屬多年生草本植物,是我國(guó)藥食兩用資源。黃精含有黃精多糖、皂苷、黃酮、生物堿等活性成分,具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂、提高免疫和腫瘤抑制等作用[1]。但生黃精對(duì)咽喉、皮膚等有刺激性,食用時(shí)有口舌麻木感,因此,黃精一般經(jīng)加工后使用,近年來(lái)在食品行業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用越來(lái)越廣泛。黃精的傳統(tǒng)加工方法以蒸煮法為主,包括單蒸、重蒸、加輔料蒸等,如目前市場(chǎng)上推出的即食黃精為九蒸九曬加工所得,直接食用或泡水泡茶,口感大大改善。然而,由于黃精中含有較多糖類成分,傳統(tǒng)加工方法長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱會(huì)因美拉德反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)多5-羥甲基糠醛,研究顯示該成分對(duì)人體橫紋肌和內(nèi)臟有毒副作用[2]。因此,尋找更有效的方法合理加工黃精具有重要意義。

應(yīng)用微生物發(fā)酵天然植物資源可改變?cè)匣钚曰蚪档推涠靖弊饔谩０l(fā)酵過(guò)程反應(yīng)條件溫和,而且在微生物代謝產(chǎn)酶作用下,可起到破壁促進(jìn)活性物質(zhì)溶出或?qū)崿F(xiàn)對(duì)底物某些活性成分的結(jié)構(gòu)修飾和轉(zhuǎn)化作用[3-5]。有研究顯示應(yīng)用黑曲霉發(fā)酵虎杖可轉(zhuǎn)化虎杖苷為白藜蘆醇[6];茵陳蒿葉被靈芝菌固態(tài)發(fā)酵后抗炎癥作用顯著增強(qiáng)[7];以釀酒酵母和赤紅曲霉共發(fā)酵番石榴后,番石榴榭皮素和總酚含量及抗氧化活性顯著提高[8];蕨菜以木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌發(fā)酵后抗炎作用也得到增強(qiáng)[9]。發(fā)酵可降解原料中的毒性成分或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為低毒物質(zhì),如銀杏葉經(jīng)發(fā)酵后銀杏酸被分解與轉(zhuǎn)化,毒副作用減弱[10]。此外,植物資源作為底物可誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生有益次級(jí)代謝產(chǎn)物如真菌多糖、紅曲Monacolin類化合物[11]等起到協(xié)同增效作用的物質(zhì)。

本研究應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)篩選出的藥(食)用菌凸圓靈芝固態(tài)發(fā)酵生黃精,比較發(fā)酵前后其抗氧化活性及刺激性的差異,并探討這些變化與發(fā)酵引起主要活性成分改變的聯(lián)系,為發(fā)酵法進(jìn)一步應(yīng)用于黃精加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精根莖 50 ℃干燥,粉碎后過(guò)40目篩備用,云南新世紀(jì)藥業(yè)有限公司;凸圓靈芝(白芝)GIM5.6 廣東省微生物菌種保藏中心(接種于玉米粉20 g/L、麩皮10 g/L、豆粕10 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO41 g/L的液體培養(yǎng)基中,150 r/min,28 ℃培養(yǎng)7 d制成液體種子備用);HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、SIRC兔角膜上皮細(xì)胞 華拓生物科技有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青試劑公司;胰蛋白酶、雙抗、人參皂苷Rb1北京索萊寶科技有限公司;所用其他試劑 均為分析純。

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;L5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;INFINITE M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海醫(yī)療器械五廠;CO2培養(yǎng)箱311型 美國(guó)Thermo Fisher;倒置顯微鏡CKX31 日本Olympus;高效液相色譜儀、Thermo ODS-2 C18柱(4. 6 mm×250 mm,5 μm) 安捷倫1260 Infinity II。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃精的加工 發(fā)酵法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精與輔料小麥麩皮按照質(zhì)量比3∶1比例混勻后滅菌備用(121 ℃滅菌20 min),在無(wú)菌條件下接種10%凸圓靈芝液體種子,于28 ℃固態(tài)發(fā)酵12 d,60 ℃干燥12 h即得黃精發(fā)酵樣。取5 g發(fā)酵樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蒸制法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精,用蒸餾水按料水比1∶20浸潤(rùn)6 h后取出,置于蒸鍋中蒸制6 h,停火燜潤(rùn)6 h,60 ℃干燥12 h即得黃精蒸制樣[12]。取5 g蒸制樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酒制法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精,按每100 kg黃精用20 kg黃酒的比例,將其悶潤(rùn)直至酒吸盡,置于蒸鍋中蒸10 h,60 ℃干燥12 h即得黃精酒制樣[13]。取5 g酒制樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 黃精的抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取1.2.1加工所得不同黃精樣液，參照文獻(xiàn)[14]中DPPH法測(cè)定抗氧化能力。設(shè)不同質(zhì)量濃度(0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL)抗壞血酸(VC)同法操作,以VC濃度為橫坐標(biāo),DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=15.45x+0.3335,R2=0.9935),計(jì)算樣品的VC當(dāng)量抗氧化能力(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity,AEAC)。

1.2.2.2 鐵離子還原能力的測(cè)定 取1.2.1加工所得不同黃精樣液，參照文獻(xiàn)[15]中鐵離子還原能力法測(cè)定抗氧化能力。設(shè)不同質(zhì)量濃度(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)VC同法操作,以VC濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=6.5815X+0.0304,R2=0.9972),計(jì)算樣品的VC當(dāng)量抗氧化能力(AEAC)。

1.2.2.3 氧化損傷的HUVEC的保護(hù)作用 利用過(guò)氧化氫建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)氧化損傷模型評(píng)價(jià)黃精的抗氧化作用[16]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,以105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板,37 ℃,CO2培養(yǎng)約24 h。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組:用完全培養(yǎng)液(89%高糖DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗)培養(yǎng)細(xì)胞,每隔24 h換1次液;過(guò)氧化氫氧化損傷組:以完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入H2O2溶液使其在孔內(nèi)終濃度為1.1 mmol/L(建模實(shí)驗(yàn)篩選濃度),誘導(dǎo)損傷4 h;黃精樣品組:預(yù)先加入1.2.1加工黃精樣品(調(diào)整樣液在孔內(nèi)濃度為原料質(zhì)量濃度10 mg/mL)培育24 h后,再加入1.1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4 h。MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.3 黃精的刺激性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用兔角膜上皮細(xì)胞(SIRC)短時(shí)暴露法評(píng)價(jià)黃精的刺激性[17-18]。選擇具有明確眼刺激性的十二烷基硫酸鈉(SDS,5 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照,甘油(10 mg/mL)為陰性對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SIRC細(xì)胞,以105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔100 μL,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后,用SDS、甘油和1.2.1不同加工方法所得黃精樣品(原料質(zhì)量濃度10 mg/mL)分別處理細(xì)胞5 min,每個(gè)樣品做6個(gè)復(fù)孔。除去樣品后用PBS洗3次,每孔中加入100 μL H-DMEM培養(yǎng)基和10 μL MTS溶液,放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h左右,于490 nm測(cè)定吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 黃精主要活性成分提取及含量測(cè)定 黃精多糖提取及含量測(cè)定:以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,按苯酚硫酸法[19]操作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=45.238x-0.0444,R2=0.9975)。取加工黃精樣品,按料液比1∶10 (w/v)加入80%乙醇70 ℃回流提取1次(1 h),過(guò)濾后濾渣加入10倍量蒸餾水95 ℃回流提取1次(1 h),過(guò)濾收集上清液,濾渣再加入7倍量蒸餾水重復(fù)提取1 h,收集上清液,合并兩次水提液,減壓濃縮至原體積1/10,加入乙醇使含醇量達(dá)75%,于4 ℃放置過(guò)夜,3000 r/min離心10 min收集沉淀,依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗,將洗滌處理后的沉淀于40 ℃烘干,即得黃精多糖粗提物。將不同加工黃精樣品按上述步驟制備多糖粗提物后用熱蒸餾水定容至100 mL同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定方法操作,計(jì)算樣品中多糖含量。

多糖含量(mg/g)=nCV1V3/WV2

式中,n為測(cè)量稀釋倍數(shù),C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得濃度,V1為測(cè)定反應(yīng)體系總體積,V2為測(cè)定取用受試樣液體積,V3為測(cè)定樣品定容總體積,W為樣品稱量質(zhì)量。

黃精皂苷提取及含量測(cè)定:以人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)品,按香草醛高氯酸比色法[20]操作,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=254.45x-0.0332,R2=0.9952)。取加工黃精樣品按料液比1∶10 (w/v)加入80%乙醇70 ℃回流提取1 h,重復(fù)提取2次后3000 r/min離心10 min收集上清液,減壓濃縮成固形物,用蒸餾水溶解后按1∶1的體積比用水飽和正丁醇萃取3次,取正丁醇相收集減壓濃縮成固形物為黃精皂苷粗提物。取0.5 g皂苷粗提物用甲醇定容至100 mL同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定方法操作,計(jì)算樣品中皂苷含量。

皂苷含量(mg/g)=nCV1V3/WV2

式中,n為測(cè)量稀釋倍數(shù),C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得濃度,V1為測(cè)定反應(yīng)體系總體積,V2為測(cè)定取用受試樣液體積,V3為測(cè)定樣品定容總體積,W為樣品稱量質(zhì)量。

黃精多糖組分含量分析:以混合單糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、巖藻糖)為標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì),按照文獻(xiàn)[21]采用柱前PMP衍生化HPLC法分析黃精多糖的單糖組成。色譜條件Thermo ODS-2 C18柱(4. 6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L pH6.7磷酸鹽緩沖液(19∶81),流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 發(fā)酵對(duì)黃精抗氧化活性及刺激性的影響

1.2.5.1 發(fā)酵黃精多糖及皂苷粗提物的抗氧化活性評(píng)價(jià) 按照1.2.4方法制備發(fā)酵黃精多糖和皂苷粗提物,設(shè)置生黃樣、發(fā)酵樣、發(fā)酵空白對(duì)照樣、單菌對(duì)照樣進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià):分別取不同處理所得黃精多糖和皂苷樣液,按照1.2.2.1操作測(cè)定DPPH自由基清除率、按照1.2.2.2操作測(cè)定鐵離子還原力。通過(guò)上樣濃度篩選實(shí)驗(yàn)后分別取黃精多糖(0.6 mg/mL)、黃精皂苷(0.4 mg/mL)按照1.2.2.3操作,評(píng)價(jià)各樣品組對(duì)HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用。

其中,發(fā)酵空白對(duì)照樣的設(shè)置是為排除發(fā)酵過(guò)程中輔料麩皮加入對(duì)活性評(píng)價(jià)造成干擾,在黃精及輔料麩皮混合滅菌后去除“接種凸圓靈芝”步驟,其余同發(fā)酵加工法操作制備所得樣品;單菌對(duì)照樣的設(shè)置是為排除凸圓靈芝發(fā)酵產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)活性評(píng)價(jià)造成干擾,以未添加黃精的麩皮基質(zhì)同發(fā)酵加工法操作制備所得樣品。

1.2.5.2 發(fā)酵黃精多糖及皂苷粗提物的刺激性評(píng)價(jià) 按照1.2.4方法制備發(fā)酵黃精多糖和皂苷粗提物,為排除發(fā)酵過(guò)程中輔料麩皮加入和凸圓靈芝發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)黃精刺激性評(píng)價(jià)造成的干擾,同1.2.5.1設(shè)置生黃精、發(fā)酵黃精、發(fā)酵空白對(duì)照樣(黃精+麩皮輔料,但不接種藥用菌發(fā)酵)、單菌對(duì)照樣(輔料麩皮+凸圓靈芝單獨(dú)發(fā)酵),同時(shí),以十二烷基硫酸鈉(SDS,5 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照,甘油(5 mg/mL)為陰性對(duì)照,取各樣品組黃精多糖和皂苷粗提物(5 mg/mL)按照1.2.3操作進(jìn)行刺激性評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理(ANOVA,Dunnett’s method),*表示具有顯著性差異(P<0.05),**表示具有極顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工方法的黃精的抗氧化活性

由表1測(cè)定結(jié)果可知,黃精經(jīng)過(guò)加工后抗氧化活性發(fā)生了改變。其中,黃精對(duì)DPPH自由基的清除能力在經(jīng)過(guò)各種方法加工后均得到了提高,且蒸制法效果較好。發(fā)酵法加工黃精后其鐵離子還原力得到了提高,蒸制及酒制黃精反而顯示出還原能力的降低,這可能與不同加工方法造成黃精中的主要活性成分如多糖、皂苷含量及其組分比例改變差異有關(guān)[13]。生黃精和加工所得黃精對(duì)氧化損傷的HUVEC細(xì)胞均有一定保護(hù)作用,但蒸制和發(fā)酵黃精的保護(hù)效果較好。其中,相比于生黃精組,發(fā)酵處理組的保護(hù)作用提高達(dá)顯著水平(P<0.05),HUVEC經(jīng)發(fā)酵黃精處理后對(duì)過(guò)氧化氫氧化損傷有良好的預(yù)防作用,細(xì)胞存活率提高到78.13%±4.25%,且效果優(yōu)于蒸制和酒制加工樣品。出現(xiàn)該趨勢(shì)主要跟發(fā)酵處理伴隨的生物轉(zhuǎn)化作用及可能產(chǎn)生某些活性代謝產(chǎn)物有關(guān)[22]。綜合三項(xiàng)考察指標(biāo),發(fā)酵法加工對(duì)提高黃精抗氧化活性更具優(yōu)勢(shì)。

表1 不同加工方法所得黃精的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of Polygonati sibiricum treated by different methods

注:HUVEC過(guò)氧化氫氧化損傷模型組的細(xì)胞存活率為54.66%±4.12%;同列不同上標(biāo)字母表示數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05。

2.2 不同加工方法的黃精的刺激性

圖1結(jié)果顯示,相比于甘油(陰性對(duì)照),生黃精表現(xiàn)出一定程度的刺激性,但SIRC細(xì)胞存活率顯著高于SDS(陽(yáng)性對(duì)照)。蒸制、酒制和發(fā)酵加工后黃精刺激性均有改善。其中,相比生黃精處理組SIRC細(xì)胞存活率(68.55%±5.23%),發(fā)酵樣細(xì)胞存活率提高到90.60%±3.55%,說(shuō)明發(fā)酵處理能顯著(P<0.05)降低生黃精的刺激性,在三種加工方法中刺激性改善效果最顯著。

圖1 不同加工方法所得黃精的刺激性Fig.1 Irritation of Polygonatum sibiricum treated by different methods注:不同上標(biāo)字母表示數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05。

2.3 不同方法加工的黃精中主要活性成分含量測(cè)定結(jié)果

如圖2結(jié)果顯示,傳統(tǒng)熱加工為主的方法與發(fā)酵法處理后黃精中的多糖及皂苷含量均有所下降。相比于生黃精,傳統(tǒng)蒸制和酒制加工后出現(xiàn)活性物質(zhì)含量減少的主要原因是由于較長(zhǎng)時(shí)間的高溫蒸制,會(huì)引起其中活性成分一定程度的分解,而且伴隨蒸氣冷凝后的流失也會(huì)帶走部分活性物質(zhì),造成多糖和皂苷含量減少相對(duì)較多。發(fā)酵加工引起的成分變化相對(duì)復(fù)雜。由于底物中加入促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的輔料麩皮中含有一定多糖成分,因此相比于生黃精,發(fā)酵前原底物多糖含量先增加,但發(fā)酵過(guò)程微生物作用下對(duì)活性成分有分解或轉(zhuǎn)化作用會(huì)引起含量減少,而藥用菌代謝可能會(huì)產(chǎn)生出新的活性物質(zhì)如真菌多糖或皂苷成分,對(duì)相應(yīng)活性物質(zhì)含量變化產(chǎn)生一定影響[23]。

圖2 不同加工方法所得黃精多糖及皂苷含量Fig.2 Concentation of total polysaccharide and and saponins of Polygonatum sibiricum treated by different methods注：不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同樣品間 數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

另外,不同的加工方法除了引起黃精中多糖和皂苷總含量的變化外,還會(huì)對(duì)這些活性成分的組分造成影響。實(shí)驗(yàn)選擇多糖中常見(jiàn)組分葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖等為單糖標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)(圖3),分析了黃精加工物中多糖的構(gòu)成組分,結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)混合單糖的HPLC圖Fig.3 HPLC spectrogram of standard mixed monosaccharide

表2 不同加工方法所得黃精總多糖粗提物的單糖組分含量(mg/g固形物)Table 2 Contents of monosaccharide components in total polysaccharide and of Polygonatum sibiricum treated by different methods(mg/gsolids)

表3 不同處理組多糖粗提物和皂苷粗提物的抗氧化能力Table 3 Antioxidant activities of polysaccharide and and saponins from different samples

注:HUVEC過(guò)氧化氫氧化損傷模型組的細(xì)胞存活率為57.02%±3.71%;同列不同上標(biāo)字母表示數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05。

由HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,生黃精多糖中含量最高的單糖組分為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。三種方法加工后所得多糖粗提物中甘露糖和阿拉伯糖含量均減少;蒸制和酒制加工引起半乳糖含量增加,而發(fā)酵處理后該成分含量降低。相比生黃精和傳統(tǒng)加工方法,發(fā)酵處理后多糖組分變化最大的區(qū)別即是鼠李糖含量增加,半乳糖醛酸含量減少;此外,生黃精中含量極少的核糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖在發(fā)酵樣中含量均較高。參照發(fā)酵空白組和單菌發(fā)酵組的測(cè)試結(jié)果,推測(cè)發(fā)酵組鼠李糖組分含量的增加并不是由生黃精和麩皮組分、菌代謝物的簡(jiǎn)單疊加引起的,因?yàn)閱尉鷮?duì)照樣中該單糖含量?jī)H為(0.89±0.01) mg/g,而發(fā)酵樣中為(20.92±0.00) mg/g,發(fā)酵過(guò)程微生物引起的組分轉(zhuǎn)化是最可能原因。甘露糖6位的羥基被氫取代后得到的衍生物即為鼠李糖;半乳糖醛酸的減少可能由菌分解所致;發(fā)酵粗多糖中增加的核糖推測(cè)是由凸圓靈芝代謝產(chǎn)生的多糖組分[24],因?yàn)樯S精和空白對(duì)照樣中該成分含量極低。木糖和巖藻糖的升高可能跟麩皮多糖組分或菌代謝產(chǎn)生多糖組分的引入有關(guān)。

2.4 發(fā)酵對(duì)黃精抗氧化活性及刺激性的影響

2.4.1 發(fā)酵黃精多糖及皂苷粗提物的抗氧化活性 生黃精經(jīng)發(fā)酵加工后抗氧化活性得到提高,刺激性降低,同時(shí)其中主要活性成分多糖和皂苷的總含量發(fā)生了改變,多糖組分也隨之變化。這提示黃精活性與刺激性的改變與加工引起的多糖和皂苷成分變化有一定聯(lián)系。因此,將發(fā)酵黃精中多糖和皂苷成分分離出來(lái),分別測(cè)試其抗氧化活性及對(duì)刺激性的影響,有助于闡明其中的內(nèi)在聯(lián)系。

表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于生黃精,發(fā)酵黃精皂苷粗提物活性變化不明顯,而發(fā)酵黃精多糖粗提物組的DPPH自由基清除率和HUVEC存活率指標(biāo)顯著(P<0.05)提高,提示黃精發(fā)酵加工后抗氧化活性的增強(qiáng)主要與多糖變化有關(guān)。實(shí)驗(yàn)考慮到發(fā)酵底物中輔料麩皮成分及微生物代謝產(chǎn)物可能給活性帶來(lái)的影響,增設(shè)了發(fā)酵空白對(duì)照樣和單菌對(duì)照樣加入分析。在多糖粗提物活性測(cè)試組中,發(fā)酵空白對(duì)照樣相比生黃精樣活性略有提高,推測(cè)麩皮中的溶出物的產(chǎn)生或短時(shí)間高溫滅菌操作對(duì)多糖的抗氧化活性和刺激性有略微影響;單菌對(duì)照樣也顯示出一定程度的抗氧化活性,推測(cè)其為發(fā)酵黃精總活性的提高起到協(xié)同增效作用。成分分析結(jié)果顯示,發(fā)酵黃精多糖含量(121.84±2.94) mg/g相比生黃精含量(141.44±2.25) mg/g有所減少,但抗氧化活性反而提高,這可能與發(fā)酵過(guò)程微生物對(duì)生黃精中原本的多糖組分轉(zhuǎn)化有關(guān)[25]。

生黃精多糖中含量較高的單糖組分甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖經(jīng)發(fā)酵后含量減少,而鼠李糖含量增加,多糖中的這些主要組分單糖含量及相互間比例的改變,可能對(duì)多糖的活性造成影響。劉柳等[26]對(duì)從黃精中分離純化的多糖進(jìn)行組分分析,發(fā)現(xiàn)其中的兩種多糖PSW4A和PSW2A-1均由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成,但各種類之間比例的差異卻顯示出僅有PSW4A具明顯的促進(jìn)免疫功能活性。因此,發(fā)酵加工黃精抗氧化活性的提高與生黃精中原多糖組分的變化及真菌多糖等成分的引入有關(guān)。

2.4.2 發(fā)酵黃精多糖及皂苷粗提物的刺激性 由圖4結(jié)果可以看出,生黃精樣皂苷提取物處理SIRC細(xì)胞存活率為50.13%±6.35%,生黃精樣多糖提取物細(xì)胞存活率為67.21%±6.34%,黃精皂苷粗提物表現(xiàn)出比黃精多糖更強(qiáng)的刺激性,可能黃精是刺激性的最關(guān)鍵成分。經(jīng)發(fā)酵后黃精多糖粗提物組及皂苷粗提物組的細(xì)胞存活率均得到提高,表明其刺激性降低。單菌對(duì)照樣對(duì)比陰性對(duì)照(甘油)顯示無(wú)刺激性,可排除輔料麩皮及微生物代謝物對(duì)刺激性的影響?？瞻讓?duì)照樣相比生黃精樣刺激性有一定改善,可能與滅菌的短時(shí)間高溫處理造成多糖和皂苷含量少量減少有關(guān)。而發(fā)酵后刺激性減弱伴隨黃精中多糖和皂苷含量的進(jìn)一步降低,尤其皂苷含量顯著降低,相對(duì)生黃精減少49.8%。

圖4 不同處理組多糖粗提物和皂苷粗提物的刺激性Fig.4 Irritation of polysaccharideand and saponins from different samples注:不同字母表示同種粗提物不同 樣品間數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

皂苷雖然具有多種功能活性,但該成分本身對(duì)黏膜有刺激性,還具有一些毒副作用[27]。有研究顯示以一定劑量茶皂苷連續(xù)灌胃處理3個(gè)月的Wistar大鼠,出現(xiàn)了消化道內(nèi)腔明顯膨脹,賁門竇粘膜上皮組織異常增生,吼黏膜壞死,氣管糜爛的現(xiàn)象[28]。皂苷苷元母核的類型或苷元上連接的糖鏈不同等會(huì)對(duì)皂苷毒性大小造成影響[29]。如有研究顯示甾體皂苷C-3位糖鏈的α-1,2連接的末端鼠李糖基是其細(xì)胞毒性的重要活性片斷。利用新月彎孢霉特異性地將其定向水解后可減輕其毒副作用[30]。鐘凌云等[31]研究發(fā)現(xiàn),酒蒸制黃精后其中的薯蕷皂苷元含量下降,而薯蕷皂苷元是其他許多皂苷元的前體,是否在加工處理后轉(zhuǎn)化為其他皂苷元尚未明確。這些研究提示黃精中的皂苷成分可能是關(guān)聯(lián)其刺激性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),發(fā)酵處理后引起其含量降低及皂苷組分結(jié)構(gòu)改變,從而刺激性減弱。此外,生黃精加工后總多糖及一些揮發(fā)性成分如正己醛、莰烯等的減少也可能對(duì)黃精毒性降低發(fā)揮了作用,這有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示,發(fā)酵法相比于傳統(tǒng)蒸制及酒制加工方法,對(duì)提高黃精抗氧化活性及降低刺激性表現(xiàn)出更突出的效果。發(fā)酵黃精活性的提升主要與其中的多糖在發(fā)酵后變化有關(guān),雖然多糖總含量降低,但多糖組分單糖相比生黃精發(fā)生了變化,含量較高的單糖組分甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖經(jīng)發(fā)酵后含量減少,而鼠李糖含量顯著(P<0.05)增加,且這些單糖間的比例也發(fā)生了變化;此外,生黃精中含量極少的核糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖在發(fā)酵黃精中含量也提高。黃精刺激性主要受皂苷成分影響更大,發(fā)酵后刺激性減弱與總皂苷含量顯著(P<0.05)降低有一定聯(lián)系,其原因可能與皂苷組分含量及結(jié)構(gòu)改變等有關(guān),同時(shí)也不排除多糖及揮發(fā)性成分如正己醛、莰烯等的影響,但其具體變化有待進(jìn)一步研究，實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用發(fā)酵法加工黃精反應(yīng)條件溫和,能更好的保留活性成分,而且發(fā)酵過(guò)程引起活性物質(zhì)發(fā)生組分轉(zhuǎn)化等可進(jìn)一步提高黃精生物活性及降低其刺激性,具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。