酶法制備紫馬鈴薯汁及其乳酸菌發(fā)酵特性

(廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所/農業(yè)部功能食品重點實驗室/ 廣東省農產品加工重點實驗室,廣東廣州 510610)

紫馬鈴薯又名紫色土豆、黑馬鈴薯、黑土豆,屬于茄科茄屬,薯型長橢圓型,表皮光滑,薯肉顏色獨特呈紫黑色,含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、有機酸等豐富的營養(yǎng)物質,具有極高的營養(yǎng)價值,紫馬鈴薯中除了普通馬鈴薯所含有的豐富的營養(yǎng)物質外,還富含具有增強人體免疫力、延緩衰老、抗氧化活性等生理活性功能的花色苷及多酚類物質[1],因此開發(fā)以紫馬鈴薯為原料的新型健康食品具有一定的實際意義。但目前紫馬鈴薯以鮮食為主,少數用于加工,綜合經濟效益較低。為順應馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略,必須大力發(fā)展馬鈴薯制品深加工產業(yè)和豐富產品種類,以提高馬鈴薯經濟附加值。

隨著經濟的發(fā)展,具有功能保健性的食品越來越受到青睞,富含多種營養(yǎng)的果蔬汁逐漸成為市場新寵,目前利用紫馬鈴薯為原料開發(fā)紫馬鈴薯飲料的相關研究已有報道,陳杰華等[2]通過酶法生產紫馬鈴薯飲料,確定紫馬鈴薯飲料的最佳酶解工藝條件;張佳麗等[3]通過感官評定法優(yōu)化紫色馬鈴薯醋飲料配方,并以離心沉淀率為指標對其穩(wěn)定劑進行優(yōu)化,得到最佳工藝;鄔婷[4]通過冷凍取汁技術確定紫色馬鈴薯的最佳處理條件,并在此基礎上確定紫色馬鈴薯飲料配方、澄清及殺菌參數,但以上相關報道主要集中于紫色馬鈴薯飲料的工藝優(yōu)化,且工藝較為單一。乳酸菌發(fā)酵能賦予果蔬良好的風味,提升果蔬汁的營養(yǎng)價值,紫色馬鈴薯中豐富的糖類物質可為乳酸菌的生長提供充足的碳源,是乳酸菌生長的良好基質[5]。

因此,本文以紫馬鈴薯為原料,通過燙漂護色酶法制備富含花色苷的紫馬鈴薯汁,經乳酸菌發(fā)酵后研制一種營養(yǎng)豐富、色澤鮮亮、風味獨特的紫馬鈴薯發(fā)酵飲料,旨在為紫馬鈴薯的產業(yè)化深加工提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫馬鈴薯(黑金剛) 購于當地農貿市場,產于山東;乳酸菌種:干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,Lc)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,Lb)及植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp) 本實驗室保存;糖化酶(100000 U/g) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;沒食子酸 美國Sigma公司;高溫α淀粉酶(20000 U/mL)、Folin-Ciocalteu試劑、果糖、葡萄糖、蔗糖、酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、草酸和檸檬酸 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

RFM3400阿貝折光計 英國Bellingham+Stanley公司;PB-10型pH計 賽多利斯公司,HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;UV-1800型分光光度計 日本島津公司;UltraScan VIS型全自動色差儀 美國HunterLab公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;Agilent 1200 series型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制汁工藝流程 新鮮紫馬鈴薯→挑選→清洗、去皮→切塊→燙漂→打漿→酶解→滅酶→離心→殺菌→冷卻→成品

1.2.2 燙漂時間對馬鈴薯汁出汁率及花色苷含量的影響 取新鮮紫馬鈴薯清洗去皮切塊(約1.5 cm×1 cm×1 cm),分別在沸水中燙漂0、1、2、2.5、3、4 min后,取出后立即用冷水將薯條表面的淀粉和泡沫沖洗干凈,瀝干,按料液比1∶1加水打漿,分別加入40 U/g高溫α-淀粉酶于90 ℃加熱60 min,待其冷卻至55 ℃后,加入0.2%(200 U/g)的糖化酶水解120 min,滅酶后(沸水浴10 min)過濾離心(1500×g,10 min)取上清液,研究燙漂時間對紫馬鈴薯汁的出汁率及花色苷含量的影響。

1.2.3 高溫α-淀粉酶用量對馬鈴薯汁出汁率、花色苷及還原糖含量的影響 經1.2.2優(yōu)化得到的紫馬鈴薯漿,分別加入不同添加量(0、20、40、60 U/g)的高溫α-淀粉酶,于90 ℃加熱60 min,待其冷卻至55 ℃后,加入0.2%(200 U/g)的糖化酶水解120 min,滅酶后(沸水浴10 min)過濾離心(1500×g,10 min)取上清液,研究高溫α-淀粉酶用量對馬鈴薯汁出汁率、花色苷及還原糖含量的影響。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵對紫馬鈴薯汁理化特性的影響

1.2.4.1 乳酸菌培養(yǎng)物制備 把3種乳酸菌(Lc、Lb及Lp)的保藏培養(yǎng)物分別置于MRS肉湯中進行活化復壯,活化復壯后再在 MRS肉湯(30 ℃,靜止發(fā)酵)中培養(yǎng)18 h。

1.2.4.2 紫馬鈴薯汁的乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng) 經酶解制備的紫馬鈴薯汁煮沸10 min,置于無菌操作臺上,分別在已滅菌的500 mL三角瓶中加入400 mL紫馬鈴薯汁,每瓶分別接入三種乳酸菌培養(yǎng)物(接種量 6.0lg CFU/mL左右),置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔12 h取樣1次,并分別測定相應的理化指標(pH、有機酸、糖組分、花色苷、總酚含量、抗氧化活性)。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 出汁率的測定 出汁率(%)=(汁液總質量-加入水質量)×100/紫馬鈴薯質量

1.2.5.2 花色苷含量的測定 花色苷含量采用pH示差法測定[6],取紫馬鈴薯汁,分別加入pH1.0和pH4.5的緩沖液,避光放置15 min,測定510和700 nm處的吸光值。

最終吸光值A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

花色苷含量(mg/L)=(A×MW×稀釋倍數×1000)/(ε×1)

以矢車菊素-3-葡萄糖苷計,其分子量MW為449.2,ε為26900 L/cm,1表示光徑為1 cm的比色皿。

1.2.5.3 還原糖含量的測定 還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS)[7]。

葡萄糖標準曲線:先將葡萄糖在105 ℃干燥至恒重,用蒸餾水配制0～1 mg/mL 的不同濃度的葡萄標準溶液。取0.5 mL葡萄糖標準溶液于具塞試管中,加入1 mL DNS試劑,混合均勻后沸水浴3 min,冷卻至室溫測定其在540 nm下的吸光值。

樣品的測定:先將酶解制備的紫馬鈴薯汁用蒸餾水稀釋到合適的濃度,取0.5 mL樣品于具塞試管中,后續(xù)步驟與標準品的測定相同。

1.2.5.4 pH的測定 pH用pH計直接測定。

1.2.5.5 有機酸的測定 參考袁星星等[8]的方法,采用HPLC法測定。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm)色譜柱;柱溫為30 ℃;檢測器為二極管陣列檢測器;流動相:0.1 mol/L(NH4)2HPO4(磷酸調節(jié)pH=2.70);流速為1.0 mL/min;檢測波長為210 nm。將樣品用0.3%偏磷酸稀釋至合適濃度后過膜,進樣量為10 μL,并采用外標法(酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、草酸和檸檬酸為標準品)定量。

1.2.5.6 糖組分測定 糖組分的測定:采用HPLC法測定,包括葡萄糖、蔗糖、果糖。色譜柱為ShodexAsahipak NH2P-50 4E(4.6 mm×250 mm)色譜柱,檢測器為蒸發(fā)光(ELSD)檢測器,柱溫40 ℃,漂移管溫度為50 ℃,流動相為70%乙腈,流速1 mL/min,取1 mL發(fā)酵紫馬鈴薯汁加3 mL無水乙醇離心取上清液過膜,進樣量為10 μL。

1.2.5.7 總酚含量的測定 采用福林酚法測定[9],結果以沒食子酸當量計。

1.2.5.8 清除DPPH自由基能力的測定 參考Sokolletowska[10]等,取50 μL 50、100、200、300、400、500 μmol/L Trolox標準溶液或稀釋后的樣品混合150 μL DPPH溶液共同置于96孔細胞板中,暗處放置30 min后,于517 nm測試吸光強度。結果以Trolox當量計算。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA方法對數據進行差異顯著性檢驗分析,以P<0.05為差異顯著,數據以平均值±標準差的形式來表示。

2 結果與分析

2.1 燙漂時間對紫馬鈴薯汁出汁率、花色苷含量的影響

不同燙漂時間對紫馬鈴薯汁的出汁率及花色苷含量的影響如圖1所示,隨著燙漂時間從1 min增加到4 min,紫馬鈴薯汁的出汁率先增加后減小,其中燙漂2.5 min時出汁率最高為69.53%。而燙漂時間對紫馬鈴薯汁的花色苷含量影響極為顯著,未經燙漂處理得到的紫馬鈴薯汁的花色苷含量僅為27.72 mg/L,因紫馬鈴薯極易發(fā)生酶促褐變,燙漂后可鈍化酶活性,從而抑制營養(yǎng)物質的氧化損失、酶褐變等一系列不良變化[11]。隨著燙漂時間的增加,紫馬鈴薯汁的花色苷含量顯著上升后有所下降,燙漂2.5 min時花色苷含量高達213.58 mg/L,比未經燙漂處理的花色苷含量提升了7.7倍,但燙漂時間大于2.5 min時,出汁率和花色苷含量均呈現(xiàn)下降的趨勢,可能由于燙漂時間過長引起汁液流失,影響了水分和花色苷的保存。另一方面從實物中也能直觀看出色澤的變化,燙漂時間為0和1 min 的馬鈴薯汁呈深褐色,而其他燙漂時間為2、2.5、3、4 min處理后的馬鈴薯汁則呈現(xiàn)清亮均一的紫紅色,與前者色澤差異明顯。綜合考慮出汁率、花色苷含量及汁液色澤,2.5 min為紫馬鈴薯最佳燙漂時間。

圖1 燙漂時間對紫馬鈴薯汁出汁率、花色苷含量的影響Fig.1 Effects of blanching time on yield and anthocyanin content of purple potato juice注:同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 高溫α-淀粉酶用量對紫馬鈴薯汁出汁率、花色苷及還原糖含量的影響

不同高溫α-淀粉酶添加量對紫馬鈴薯汁的出汁率及花色苷含量的影響如表1所示,未添加高溫α-淀粉酶,只經過糖化酶水解的馬鈴薯漿較粘稠,出汁率較低為48.19%±2.36%,花色苷含量也最低,經高溫α-淀粉酶先液化再糖化的馬鈴薯汁出汁率顯著增加,花色苷含量亦隨之升高,高溫α-淀粉酶添加量為20 U/g時,出汁率和花色苷含量均達到最大值分別為69.80%±3.85%和218.25±1.89 mg/L。從還原糖含量變化來看,未添加高溫α-淀粉酶,只經過糖化酶水解得到的馬鈴薯汁還原糖含量與其他組差異顯著。在0～20 U/g用量范圍內,隨著酶用量的增大,馬鈴薯汁中還原糖含量顯著提高;當酶用量大于20 U/g時,繼續(xù)增大酶用量,還原糖含量變化不顯著,說明此時馬鈴著漿中的淀粉已經基本被水解完全。α-淀粉酶使得淀粉分子內部的α-1,4-糖苷鍵發(fā)生改變,將淀粉水解為糊精、低聚糖和單糖;再加入糖化酶可以進一步水解糊精和多糖[12]。從而充分利用紫馬鈴薯中大量的淀粉,改善飲料的穩(wěn)定性和口感,使細胞內的花色苷更完全地釋放出來。

表1 高溫α-淀粉酶用量 對紫馬鈴薯汁出汁率、花色苷及還原糖含量的影響Table 1 Effect of high temperature α-amylase dosage on the juice yield,antocyanin and sugar content of purple potato juice

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),表2、表3同。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中pH的變化

表2 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中有機酸的變化Table 2 Changes of organic acids in purple potato juice during fermentation

由圖2可知,酶法制備的紫馬鈴薯汁的最初pH約為5.98。在48 h 內,隨著發(fā)酵時間的延長,3種乳酸菌發(fā)酵的紫馬鈴薯汁的pH均呈下降趨勢;其中,0～12 h下降幅度最大,從5.98下降至4.0左右;主要是乳酸菌的快速增殖消耗糖代謝產酸的原因[13];12 h后Lc發(fā)酵的紫馬鈴薯汁的 pH變化不大,而Lb及Lp發(fā)酵的紫馬鈴薯汁的pH仍然緩慢下降,48 h時pH分別下降至3.44和3.67。隨著發(fā)酵的進行,樣品中累積大量有機酸,酸性的樣品環(huán)境和高濃度的H+,會抑制乳酸菌生長,菌的產酸能力受到影響,發(fā)酵后期pH變化不大。

圖2 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中pH的變化Fig.2 Changes of pH value in purple potato juice during fermentation

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中有機酸的變化

利用HPLC對發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中有機酸進行測定,結果如表2所示。有機酸是果蔬的主要風味營養(yǎng)物質,對發(fā)酵果蔬的品質有著重要的影響[14]。紫馬鈴薯汁中含有酒石酸、蘋果酸、乳酸、草酸等有機酸,經乳酸菌發(fā)酵后有機酸含量增加,其中乳酸含量變化最顯著,發(fā)酵48 h后,Lc、Lb及Lp發(fā)酵后的乳酸含量分別從0.46 g/L提升至8.43、21.64、16.49 g/L;酒石酸含量亦有顯著的增加,經Lc、Lb及Lp發(fā)酵后分別從1.08 g/L提升至1.36、1.74、1.48 g/L;蘋果酸的變化趨勢與乳酸菌的種類有關,經Lc、Lb發(fā)酵后蘋果酸完全被消耗,可能是由于在乳酸菌蘋果乳酸酶的作用下發(fā)生脫羧反應生成了乳酸和CO2,使蘋果酸含量逐漸減少;但經Lp發(fā)酵24 h后蘋果酸含量從0.80 g/L增加到2.70 g/L。草酸在發(fā)酵期間變化量較小,且三種菌差異不大,可能是微生物發(fā)酵未對紫馬鈴薯汁中的草酸進行轉化。乙酸和檸檬酸均為從無到有的積累,發(fā)酵后乙酸含量從高到低依次為:Lp>Lc>Lb,發(fā)酵后檸檬酸含量從高到低依次為:Lb>Lp>Lc,發(fā)酵過程中有機酸含量的增加有利于風味的增加,縮短發(fā)酵時間,抑制腐敗菌的產生。

2.5 不同乳酸菌發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中糖含量的變化

表3 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中糖組分的變化Table 3 Changes of sugar component in purple potato juice during fermentation

由表3可知,紫馬鈴薯汁的主要糖組成為葡萄糖(26.98±0.13 g/L)、蔗糖(8.99±0.02 g/L)、果糖(2.88±0.09 g/L)。對于Lc組,發(fā)酵48 h時,蔗糖由發(fā)酵前的8.99±0.02 g/L顯著降低到4.01±0.03 g/L(P<0.05),葡萄糖由26.98±0.13 g/L增加到29.87±0.16 g/L,果糖由2.88±0.09 g/L增加至5.68±0.02 g/L,蔗糖含量的減少可能是在蔗糖酶的作用下被轉化為葡萄糖和果糖;葡萄糖和果糖的變化趨勢相似,發(fā)酵后兩種糖含量均稍有升高,可能是由于蔗糖的轉化所致;對于Lb組,發(fā)酵48 h時,蔗糖由發(fā)酵前的8.99±0.02 g/L顯著降低到5.07±0.02 g/L(P<0.05),葡萄糖由26.98±0.13 g/L減少到18.99±0.06 g/L,果糖完全被消耗,Lp對糖的利用與Lb相似,這兩種菌對糖類的消耗大于Lc,與其產酸能力相對應。減少的糖類主要用于乳酸菌的生長以及參與代謝過程被轉化成有機酸等其他物質。

2.6 不同乳酸菌發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中花色苷、總酚含量及抗氧化性(DPPH)的變化

如圖3所示,紫馬鈴薯汁經乳酸菌發(fā)酵后花色苷含量均呈下降的趨勢,經Lc、Lb及Lp發(fā)酵48 h后分別從194.54±3.07 mg/L下降至161.81±1.65、172.50±4.96、168.83±3.07 mg/L,降解率分別為17.82%、11.33%、13.22%?；ㄉ蘸肯陆悼赡苁怯捎诨ㄉ辗€(wěn)定性差,在發(fā)酵過程中其自身會發(fā)生降解,也會受到乳酸菌轉化作用的影響。

如圖4所示,紫馬鈴薯汁經乳酸菌發(fā)酵后總酚含量均呈略微下降的趨勢,經Lc、Lb及Lp發(fā)酵后分別從1136.67±33.76 mg/L下降至1065.95±22.93、1048.83±38.22、1063.24±22.63 mg/L,保留率分別為93.78%、92.27%、93.54%?？偡优c花色苷含量下降幅度有所差異,且總酚下降程度低于花色苷,表明發(fā)酵過程中會有某些酚酸類物質的增加,且發(fā)酵期間花色苷、酚酸的合成和降解與乳酸菌種類有關。一些乳酸菌(如Lp)在發(fā)酵過程中會產生酚酸脫羧酶,實現(xiàn)酚類物質的相互轉化,乳酸菌產生的酚酸脫羧酶,可以把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質,從而使總酚含量增加[15]。

圖3 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中花色苷含量的變化Fig.3 Changes of anthocyanin content in purple potato juice during fermentation

如圖5所示,紫馬鈴薯汁經乳酸菌發(fā)酵后抗氧化活性呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢,經Lc、Lb及Lp發(fā)酵48 h后分別從4.09±0.31 μmol TE/mL下降至3.09±0.19、3.10±0.12、2.96±0.25 μmol TE/mL,降解率分別為24.41%、24.23%、27.62%。紫馬鈴薯汁的抗氧化活性下降的原因可能是花色苷和總酚含量的減少,這與李豐廷等的研究結果一致[16]。

圖4 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁中總酚含量的變化Fig.4 Changes of total phenolic content in purple potato juice during fermentation

圖5 發(fā)酵期間紫馬鈴薯汁的 DPPH自由基清除能力的變化Fig.5 Changes of DPPH· scavenging ability of purple potato juice during fermentation

3 結論

紫馬鈴薯經燙漂護色2.5 min時出汁率最高。燙漂時間對紫馬鈴薯汁的花色苷含量影響極為顯著,燙漂2.5 min時花色苷含量比未經燙漂處理的提升了7.7倍。經高溫α-淀粉酶(20 U/g)、糖化酶(200 U/g)酶解處理后的紫馬鈴薯汁出汁率為69.80%±3.85%,總酚含量1136.7±33.76 mg/L,花色苷含量為218.25±1.89 mg/L。紫馬鈴薯汁經乳酸菌發(fā)酵過程中pH逐漸下降,并產生大量的乳酸,產酸能力大小依次為Lb>Lp>Lc,蔗糖、葡萄糖和果糖在發(fā)酵過程中均作為底物被乳酸菌消耗,用于乳酸菌的生長以及在發(fā)酵代謝中轉化成其他的有機酸等營養(yǎng)物質,發(fā)酵48 h后花色苷、總酚、DPPH·清除能力分別下降了11.33%～17.82%、6.22%～7.73%、24.23%～27.62%。發(fā)酵期間花色苷、酚酸的合成和降解與乳酸菌種類有關,抗氧化活性下降與花色苷和總酚含量的減少有關。