無水磷酸氫鈣固化姜黃素磷脂復(fù)合物

張煥煥劉 藝張 蘭范君婷鞠建明*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；3.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166）

姜黃素是從姜黃干燥根莖中提取純化出的一種酚類化合物［1］，具有多種藥理活性，如抗癌、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗菌等［2-4］，被認為是一種安全的植物成分，沒有顯著毒性和致畸性，亞洲許多國家和地區(qū)廣泛用作香料、膳食補充劑、藥物成分［5-6］。但姜黃素水溶性差，并且代謝迅速和全身消除快速，導(dǎo)致該成分生物利用度較低，從而限制了臨床應(yīng)用［7-8］。

現(xiàn)代研究表明，姜黃素、石杉堿甲、小檗堿等多種難溶性成分的磷脂復(fù)合物能有效地提高其溶解度、溶出率、口服生物利用度［9-11］。磷脂是細胞膜的基本成分之一，跨膜能力強，藥物與其結(jié)合后親脂性和跨膜吸收能力增加［12］，同時它可提高水溶性、脂溶性藥物溶解度［13］。但磷脂復(fù)合物黏性大，影響藥物釋放，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，故必須使用適當(dāng)?shù)妮o料來改善其流動性和可壓縮性。

無水磷酸氫鈣是白色單斜晶系結(jié)晶粉末，具有低吸濕性及良好的流動性、可壓縮性，常用于藥物制劑的輔料，如直接壓片賦形劑、潤滑劑，以改善片劑壓縮特性和流動性［14］，但目前尚無應(yīng)用其作為賦形劑固化磷脂復(fù)合物以改善流動性、溶出度的報道。因此，本實驗擬采用無水磷酸氫鈣作為載體材料，將姜黃素磷脂復(fù)合物固化成粉末，并對其流動性、體外溶出度、生物利用度進行評價，以期確定其可行性。

1 材料

1.1 儀器 DSC449F3 差示掃描量熱儀（德國Netzsch 公司）；6390LV 掃描電鏡（日本電子株式會社）；紅外光譜儀（美國Ominic 公司）；D／max 2500／PC 轉(zhuǎn)靶X 射線衍射儀（日本理學(xué)株式會社）；Waters 高效液相色譜儀（配置Alliance 2695四元泵及自動進樣系統(tǒng)、Waters 2996 PDA 檢測器）；RCZ8M 溶出儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；純化水裝置（美國Millipore 公司）；AT201電子天平（十萬分之 一，瑞 士 Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑與藥物 姜黃素（質(zhì)量分數(shù)＞97%，大連美侖生物科技有限公司）；無水磷酸氫鈣（上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司）；卵磷脂（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）。無水乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈為色譜純（美國天地公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 動物 SD 雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2014-0001。

2 方法

2.1 磷脂復(fù)合物制備 稱取適量姜黃素和磷脂（1∶2）于燒杯中，加入10 mL 無水乙醇，37 ℃下磁力攪拌2 h，完全溶解后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，60 ℃下蒸去無水乙醇，刮下半固體，即得，置于干燥器中備用。

2.2 固化粉末制備 采用溶劑蒸發(fā)法［15］。稱取適量磷脂復(fù)合物和無水磷酸氫鈣（1∶2）于燒杯中，加入10 mL 無水乙醇，37 ℃下磁力攪拌2 h，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，60 ℃下蒸去無水乙醇，刮下固體，即得，置于干燥器中備用。

2.3 物理混合物制備 稱取適量姜黃素、磷脂、無水磷酸氫鈣（1∶2∶6），置于研缽中混合均勻，過50 目篩，即得，置于干燥器中用。

2.4 樣品表征

2.4.1 掃描電子顯微鏡（SEM）稱取適量姜黃素、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末，在其表面真空鍍金70 s，再通過SEM 觀察樣品表面和晶體結(jié)構(gòu)。

2.4.2 差示掃描量熱法（DSC）以空鋁鉗鍋為參比物，在另一鋁鍋中放入一定量樣品，載氣氮氣，升溫速率20 ℃／min，升溫范圍0～300 ℃，對姜黃素、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末進行DSC 分析。

2.4.3 X 射線衍射（XRD）測試條件為Cu 靶（40 kV，25 mA），步進掃描0.01°／步，掃描范圍5°～70°，掃描速度4°／min，對姜黃素、無水磷酸氫鈣、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末進行XRD 分析。

2.4.4 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）取適量姜黃素、無水磷酸氫鈣、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進行FTIR分析。

2.5 流動性 采用固定漏斗法［16］。將漏斗置于水平表面的固定高度，固化粉末倒入漏斗中，輕微振動，滑下的粉末形成錐體，記錄錐體平均直徑（D）和粉末堆積高度（h），計算休止角θ，公式為tanθ＝2h／D。

2.6 體外溶出度研究 采用2015 年版《中國藥典》四部通則中溶出度與釋放度測定法中的第一法（籃法）。稱取適量姜黃素、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末（相當(dāng)于含姜黃素5 mg）裝于空膠囊中，設(shè)定轉(zhuǎn)速100 r／min，溫 度（37±0.5）℃，溶出介質(zhì)900 mL 磷酸鹽緩沖液（pH＝1.2 或6.8）［17-18］。于5、10、20、30、45、60 min各取樣5 mL，同時補加同溫等量溶出介質(zhì)，13 000 r／min離心10 min，取上清測定姜黃素含有量，計算其累積溶出率，繪制溶出曲線，平行3 份。

2.7 體內(nèi)藥動學(xué)行為研究

2.7.1 血漿樣品的制備 24 只大鼠隨機分成4組，每組6 只，實驗前禁食12 h，自由飲水，按100 mg／kg 劑量分別灌胃給予姜黃素、物理混合物、磷脂復(fù)合物、固化粉末（混懸于0.5% CMCNa 溶液中）。于0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10 h 眼眶靜脈叢取血各0.5 mL，置于肝素化離心管中，4 ℃下4 000 r／min 冷凍離心10 min，取上清，保存于－80 ℃冰箱中［19］。

2.7.2 血漿樣品處理 吸取血漿樣品100 μL 于離心管 中，加 入10 μg／L 內(nèi)標溶液（葛根素）10 μL，渦旋10 s，加500 μL 乙腈，再渦旋3 min，15 000 r／min 離心5 min，取上清液，氮氣吹干后加入100 μL 乙腈-水（1∶1）復(fù)溶，3 500 r／min離心5 min，取上清待測。HPLC 分析時，取20 μL等分試樣注入。

2.7.3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)血藥濃度-時間曲線，得到藥峰濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）；通過DAS 1.1.1 軟件，對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行非房室擬合分析，計算其他藥動學(xué)參數(shù)；采用SPSS 23.0 軟件，對主要藥動學(xué)參數(shù)進行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)以（±s）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SEM 分析 圖1 顯示，姜黃素、物理混合物中能發(fā)現(xiàn)明顯晶體，而在磷脂復(fù)合物、固化粉末中消失，呈現(xiàn)無定形狀態(tài)，表明姜黃素可與磷脂完全結(jié)合，從而使前者在磷脂復(fù)合物中從結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。

圖1 樣品SEM 圖Fig.1 SEM images for samples

3.2 DSC 分析 圖2 顯示，姜黃素、物理混合物在183.5 ℃附近有晶體吸熱峰，而無水磷酸氫鈣沒有；物理混合物在115 ℃附近出現(xiàn)1 個寬吸熱峰，它低于姜黃素晶體峰，可能是由于有一部分受到磷脂、無水磷酸氫鈣干擾，導(dǎo)致吸熱峰有所減弱；磷脂復(fù)合物、固化粉末中上述2 個峰均消失，表明藥物以無定形或非晶體狀態(tài)存在，與“3.2”項下結(jié)果一致。

3.3 XRD 分析 圖3 顯示，姜黃素在5°～35°處具有較強的特征衍射峰，在17.8°處為其晶體特征峰；物理混合物中盡管大多數(shù)峰消失，但仍可觀察到姜黃素特征峰，表明該成分僅與無水磷酸氫鈣和磷脂物理混合，并且仍以結(jié)晶形式存在；磷脂復(fù)合物、固化粉末中姜黃素特征衍射峰均消失，提示該成分可能以無定形狀態(tài)存在。

3.4 FTIR 分析 圖4 顯示，姜黃素在3 434、1 511 cm－1處有強烈的特征吸收峰，前者是該成分苯環(huán)骨架峰，而后者為酚羥基伸縮振動；無水磷酸氫鈣在1 200 cm－1處顯示出特征性P＝O 吸收帶；物理混合物在1 200 cm－1處存在P＝O 吸收帶，3 400 cm－1處有酚羥基吸收帶；磷脂復(fù)合物、固化粉末在3 400 cm－1處酚羥基峰吸收加強，可能是由于輔料和磷脂結(jié)構(gòu)中羰基振動的疊加所致，推測后者中各物質(zhì)之間沒有形成新化學(xué)鍵，可能通過分子間作用力而結(jié)合。

圖2 樣品DSC 圖Fig.2 DSC pattern for samples

圖3 樣品XRD 圖Fig.3 XRD pattern for samples

圖4 樣品FTIR 圖Fig.4 FTIR pattern for samples

3.5 流動性考察 磷脂復(fù)合物呈不流動半固體狀態(tài)，而加入無水磷酸氫鈣作為載體后固化粉末休止角為30°，更有利于生產(chǎn)。

3.6 溶出度考察 圖5 顯示，磷酸鹽緩沖液（pH＝1.2 或6.8）中固化粉末累積溶出率高于磷脂復(fù)合物、物理混合物、姜黃素，這是因為無水磷酸氫鈣存在較高的孔隙率，能使藥物分散更均勻，溶出速率加快。

圖5 樣品累積溶出曲線Fig.5 Accumulative dissolution curves for samples

3.7 生物利用度 圖6、表1 顯示，固化粉末Cmax、AUC 顯著高于磷脂復(fù)合物、物理混合物、姜黃素（P＜0.05），t1／2顯著降低（P＜0.05），相對口服生物利用度較磷脂復(fù)合物增加了1.53 倍。

圖6 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.6 Plasma concentration-time curves for samples

4 討論

由于姜黃素水溶性差、生物利用度低，本實驗通過將其制成磷脂復(fù)合物來增強該成分膜滲透性，但由于磷脂復(fù)合物黏性大、流動性差，故采用無水磷酸氫鈣作為載體固化磷脂復(fù)合物形成粉末，從而增加其流動性。結(jié)果顯示，姜黃素與無水磷酸氫鈣具有良好的相容性，前者在固化粉末中以穩(wěn)定的無定形狀態(tài)存在，同時磷脂復(fù)合物的溶出速率也有所提高。評估了固化粉末的生物利用度，發(fā)現(xiàn)它與傳統(tǒng)姜黃素磷脂復(fù)合物相比有明顯的改善作用。因此，無水磷酸氫鈣不僅可用于改善磷脂復(fù)合物的流動性，有利于以后固體劑量處理，而且還可增加其復(fù)合物溶出速率，從而改善口服生物利用度。

表1 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

表1 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

注：與磷脂復(fù)合物比較，*P＜0.05。