南極磷蝦酶解工藝優(yōu)化及酶解產(chǎn)物對牡蠣肉的冷凍保護作用

,2,3,4,5,*,2,3,4,5,2,3,4,5

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心,廣東湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;4.廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東湛江 524088;5.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088)

水產(chǎn)品本身具有水分含量高、內(nèi)源酶活力強等特點,容易發(fā)生腐敗變質(zhì),在長時間儲存或運輸過程中通常采用凍藏來保證品質(zhì)不發(fā)生劣變[1]。產(chǎn)品在長期凍藏過程中,低溫會導致肌肉蛋白質(zhì)(主要是肌原纖維蛋白)發(fā)生冷凍變性,而冷凍變性致使水產(chǎn)品口感風味改變及營養(yǎng)價值降低[2-3],在工業(yè)生產(chǎn)中使用抗凍劑如含磷抗凍劑及糖類抗凍劑來解決該問題。但含磷抗凍劑如多聚磷酸鹽類,與體內(nèi)鈣質(zhì)結(jié)合會造成鈣磷失衡[4],傳統(tǒng)糖類抗凍劑如蔗糖因甜度高、熱量高等特點,會影響產(chǎn)品風味[5]。

研究表明,蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的多肽可以有效抑制水產(chǎn)品冷凍變性,同時具有較低的甜度[6]。目前抗凍多肽主要來源有各種魚類蛋白如鱈魚肉[7]、各種動物皮膚中的膠原蛋白、明膠[8]、蝦的邊角料[9]等,但這些原料受到來源及提取條件等因素的限制,還不能達到商業(yè)化應用的程度。南極磷蝦(Antarctic krill)生物資源量巨大[10],具有抗菌、降血壓、抗氧化及抗疲勞耐缺氧等生物活性[11],而其冷凍保護研究較少,馬慶保等[12]研究發(fā)現(xiàn),南極磷蝦適應極寒環(huán)境產(chǎn)生的抗凍蛋白具有冰晶生長抑制特性。因此,南極磷蝦蛋白是抗凍肽的一種潛在、良好的天然來源。

目前,研究抗凍多肽冷凍保護效果時,一般將其添加至魚糜或魚肉[13]中,而貝類冷凍保護研究較少。而牡蠣近年來產(chǎn)量不斷增加,主要采用冷凍保鮮銷往全國,是目前一種重要的食用海產(chǎn)品[14]。因此本研究以南極磷蝦為原料進行酶解工藝優(yōu)化,并將所得到的酶解產(chǎn)物添加至牡蠣肉中,通過測定牡蠣肉凍藏后失水率、鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase酶活力及總巰基含量變化,對其冷凍保護效果進行評價,為南極磷蝦高值化利用及研發(fā)新型抗凍劑提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍南極磷蝦 山東棗莊漁源水族;新鮮牡蠣 湛江東風市場;堿性蛋白酶(2.4 AU/g) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶(酶活力4000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力100000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力100000 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;溶菌酶(14300 Da)、維生素B12(1355.38 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da) Sigma公司;超微量Ca2+-ATPase酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;Folin-酚試劑盒、二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 上海滬試化工有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 上?；瘜W試劑有限公司;試劑 無特殊說明均為分析純。

VOPADEST450全自動凱氏定氮儀 廣州德資格哈特儀器有限公司;UV2550紫外分光光度計、LC20AD高效液相色譜儀 日本島津公司;FDU-1100真空冷凍干燥機 埃朗科技國際貿(mào)易有限公司;N-1100V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海埃朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦的酶解方法 參照張元元等[15]方法有所改動。將購買的南極磷蝦于室溫解凍6 h,清洗后取一定南極磷蝦按1∶5的料液比加入蒸餾水打碎后勻漿15 min,加入蛋白酶后調(diào)節(jié)pH,水浴加熱至所需溫度保溫酶解,在此過程中保持體系pH不變。酶解結(jié)束后,在100 ℃下加熱10 min滅酶,后于4 ℃、8000 r/min離心20 min。將上清液在真空度為0.1 MPa、溫度為50 ℃旋轉(zhuǎn)真空濃縮后進行真空冷凍干燥(-45 ℃、20 Pa),干燥完成后裝入密封袋中于4 ℃保存。

1.2.2 南極磷蝦酶解條件的優(yōu)化

1.2.2.1 南極磷蝦酶解用酶篩選 參照張元元等[15]方法有所改動。選擇胰蛋白酶(37 ℃,pH8.0)、中性蛋白酶(50 ℃,pH6.0)、堿性蛋白酶(55 ℃,pH10)及木瓜蛋白酶(50 ℃,pH7.0),添加量為1.6%,酶解時間5 h,底物濃度為20%條件下進行酶解,以水解度為指標進行篩選。

1.2.2.2 單因素實驗 根據(jù)蛋白酶篩選實驗結(jié)果,固定條件為:酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、pH10、加酶量1.6%及底物濃度為20%,設(shè)置各因素水平為酶解溫度40、45、50、55、60 ℃;pH8、8.5、9、9.5、10;加酶量1.2%、1.6%、2%、2.4%、2.8%;酶解時間4.5、5、5.5、6、6.5 h。酶解具體方法按1.2.1進行,研究各因素對水解度的影響。

1.2.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取酶添加量、溫度、pH、酶解時間四個因素,以水解度為指標,進行四因素三水平正交試驗,確定最佳的酶解條件組合。

表1 堿性蛋白酶水解正交試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels codingTable for alkaline protease hydrolysis orthogonal test

1.2.3 水解度的測定方法 水解度的計算公式為:

水解度DH(%)=酶解液中游離氨基態(tài)氮的含量(g)/原料中總氮×100

式中:原料中總氮為用凱氏定氮法測定樣品中的總氮含量[16];酶解液中游離氨基酸態(tài)氮為用甲醛滴定測定的酶解液中游離氮含量[17]。

1.2.4 南極磷蝦酶解產(chǎn)物分子量測定 參照李婉等[18]方法稍作修改,采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)進行分子量測定。色譜條件:流動相為Tris-HCl緩沖液(pH8.3、0.05 mol/L);色譜柱:Waters Protein-pak 60A(WAT085250);洗脫速度0.7 mL/min;25 ℃柱溫。樣品稀釋后上樣,上樣量20 μL,檢測波長214 nm。標準品為:維生素B12(1355.38 Da)、溶菌酶(14300 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da)。以保留時間(t)為橫坐標和分子量的對數(shù)lgM為縱坐標作圖,得到分子量回歸方程為:lgM=-0.4567t+8.9462(R2=0.9976)。

1.2.5 南極磷蝦酶解產(chǎn)物的冷凍保護作用研究

1.2.5.1 凍藏牡蠣預處理 將新鮮牡蠣洗凈去除雜質(zhì),取出牡蠣貝肉4 ℃蒸餾水清洗后切成大小均勻的塊狀。將得到的牡蠣肉分成三份,按照牡蠣肉重量的0.5%添加復合磷酸鹽混勻為含磷抗凍劑組;按照牡蠣肉重量的5%添加南極磷蝦酶解產(chǎn)物粉末混勻為南極磷蝦酶解產(chǎn)物組;不經(jīng)任何處理為空白對照組。將樣品放進-75 ℃的冰箱速凍2 h轉(zhuǎn)移至-18 ℃的冰箱中進行冷凍保藏。

1.2.5.2 解凍失水率測定 按照俞裕明等[19]的方法測定解凍失水率:將經(jīng)過凍藏牡蠣肉取出在4 ℃冰箱放置12 h進行解凍,用濾紙吸干表面水分進行稱重,并按照下式計算解凍失水率:

1.2.5.3 鹽溶性蛋白提取及含量測定 基于萬建榮[20]的方法稍作修改:準確稱取3 g解凍后的牡蠣肉加入30 mL磷酸鹽緩沖液(I=0.05,pH=7.5)研磨提取5 min后,于4 ℃、8000 r/min下離心15 min,除去上清液,再次加入磷酸鹽緩沖液研磨提取離心,重復三次。在離心后得到的沉淀中加入30 mL的pH7、0.6 mol/L NaCl溶液,混勻后在4 ℃冰箱中提取20 h于4 ℃、8 000 r/min下離心15 min,所得上清液即為鹽溶性蛋白溶液。采用Folin試劑盒對上清液進行蛋白質(zhì)含量測定,所得結(jié)果即為樣品中鹽溶性蛋白的含量。

1.2.5.4 總巰基含量測定 參照Benjakul[21]方法,取0.5 mL鹽溶性蛋白溶液加入試管中,然后加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(含有8 mol/L尿素、2% SDS、10 mmol/L EDTA、pH=6.8),取4 mL混合液加入0.4 mL 0.1% DTNB溶液(溶于0.2 mol/L的Tris-HCl中,pH=8.0),混勻后40 ℃水浴加熱25 min,在412 nm處測定吸光值?？瞻捉M以0.6 mol/L NaCl溶液代替樣品。按下列公式計算總巰基含量(mol/L)。

式中:A-樣品在412 nm處的吸光值;D-稀釋倍數(shù);ε-摩爾消光系數(shù)13600/(mol·L-1·cm)。

1.2.5.5 Ca2+-ATPase酶活力測定 采用超微量Ca2+-ATP試劑盒對牡蠣肉提取的鹽溶性蛋白進行Ca2+-ATPase酶活力測定,按下列公式進行計算:

式中:其中A表示樣品測定管吸光值;B表示對照管吸光值;C表示標準管吸光值;D表示空白管吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件和Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦酶解蛋白酶篩選結(jié)果

選擇胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶分別在其最適條件下對南極磷蝦進行酶解,以水解度為評價指標,四種酶水解度如圖1所示。由圖1可知,在最適條件下堿性蛋白酶的水解度最高,為10.94%±0.4%,顯著(P<0.05)高于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶,其他三種酶的水解度無顯著性差異,因此選用堿性蛋白酶作為實驗用酶。

圖1 各種蛋白酶水解效果比較Fig.1 Comparison of efficiency of hydrolysis of different proteases注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,隨著溫度的升高,酶解液的水解度先增加后降低,水解度在55 ℃時最大。在溫度低于55 ℃時,堿性蛋白酶的催化速率隨著隨溫度上升而增加,因此水解度出現(xiàn)上升;當溫度超過最適溫度范圍時,蛋白酶高溫變性以及酶解產(chǎn)物的增加抑制酶解反應的進行[22],導致水解度降低,因此選擇的水解溫度為55 ℃。

圖2 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.2 Influence of enzymatic temperature on hydrolysis degree of Antarctic krill

圖3 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.3 Influence of pH on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.2.2 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,隨著pH的增加,酶解液的水解度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在pH為8.5時水解度最高。這是因為酶與底物的結(jié)合和催化反應常取決于底物和酶分子的電荷分布,pH變化影響酶與底物電荷分布,從而影響酶解反應的進行,過酸或過堿均影響蛋白酶活性[23]。在pH超過8.5時,蛋白酶活性下降,從而使水解度出現(xiàn)下降。因此,堿性蛋白酶酶解南極磷蝦最佳pH為8.5。

2.2.3 加酶量對南極磷蝦酶解水解度的影響 加酶量對南極磷蝦酶解水解度的影響如圖4所示。由圖4可知,隨著加酶量的增加,南極磷蝦水解度上升,在添加量為2.4%時,水解度最高,但加酶量繼續(xù)增加時水解度下降。這是因為體系內(nèi)酶解效率隨著酶添加量的增加而提高,酶解效率逐漸升高;隨著酶添加量的繼續(xù)增加,反應體系出現(xiàn)酶過剩的現(xiàn)象,抑制酶解反應的進行[23],同時增加實驗成本,因此最佳加酶量為2.4%。

圖4 加酶量對南極磷蝦水解度的影響Fig.4 Influence of enzymatic dosage on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.2.4 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,水解度隨著酶解時間的增加先升高后下降,在5 h時水解度最高。這是因為,隨著反應的進行,酶與底物逐漸結(jié)合,催化反應向正方向進行,水解度不斷增加,但隨著反應的繼續(xù)進行,酶解產(chǎn)物濃度增加,競爭性抑制作用變強,新生成的小分子肽、氨基酸等產(chǎn)物使催化反應向逆反應方向進行[24],造成水解度下降。因此最佳酶解時間為5 h。

圖5 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.5 Influence of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.3 南極磷蝦酶解正交試驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,以水解度為指標選用四因素三水平的正交試驗(見表1)對南極磷蝦酶解工藝條件進一步優(yōu)化,試驗優(yōu)化結(jié)果如表2所示。由直觀分析法得出,時間、加酶量、溫度及pH四個因素對水解度均有影響,根據(jù)極差R值分析顯示各因素對水解度影響大小為:加酶量>pH>酶解溫度>酶解時間,即加酶量對實驗影響最大。正交優(yōu)化得到最佳酶解工藝參數(shù)為:A2B2C3D2,即pH8.5,酶解溫度為55 ℃,加酶量2.6%,酶解時間為5 h。此條件不在正交表中,進行驗證實驗得到在此條件下的水解度為23.85%±0.95%。

2.4 南極磷蝦酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布

南極磷蝦酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布結(jié)果如表3和圖6所示。南極磷蝦酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量主要分布在100～5500 Da,占總酶解產(chǎn)物的79.69%。與李曉坤、孫麗潔等[25-26]的研究結(jié)果一致。李曉坤[25]研究得到的抗凍多肽分子量分布在150～2000 Da;孫麗潔等[26]得到的抗凍多肽分子量主要分布在小于3000 Da。目前研究的結(jié)果表明抗凍多肽相對分子質(zhì)量較低,具有較強的抗凍活性,這可能是因為分子質(zhì)量小的多肽更容易與冰晶表面結(jié)合,阻礙冰晶生長,而小分子肽也可以與水形成氫鍵,增強凍結(jié)過程水的穩(wěn)定性,減少大冰晶的形成[27]。因此經(jīng)過工藝優(yōu)化得到的南極磷蝦酶解產(chǎn)物可能具有一定的抗凍活性。

表3 南極磷蝦酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布表Table 3 Molecular weight distribution of the enzyme hydrolysate of Antarctic krill

圖6 南極磷蝦酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布圖Fig.6 Molecular weight distribution of the enzyme hydrolysate of Antarctic krill

2.5 南極磷蝦酶解產(chǎn)物對牡蠣肉的冷凍保護作用

2.5.1 凍藏過程中各處理組牡蠣肉解凍失水率變化 如圖7所示,各樣品組隨著凍藏時間的增加,均出現(xiàn)失水現(xiàn)象。這是因為牡蠣肉在凍藏過程形成冰晶,導致組織結(jié)構(gòu)受損,解凍后的水分不能被其組織全部吸收,從而造成部分汁液流失[28]。凍藏10 d時,各處理組的失水率之間差異不顯著,隨著凍藏繼續(xù)進行,凍藏25 d后空白對照組的失水率為10.11%,添加量0.5%的含磷抗凍劑組和添加量為5%酶解產(chǎn)物均可以抑制牡蠣肉失水現(xiàn)象,其失水率分別為6.56%、5.00%。添加量0.5%含磷抗凍劑組及添加量5%酶解產(chǎn)物組失水率極顯著低于空白對照度(P<0.01),而酶解產(chǎn)物組抑制效果明顯優(yōu)于含磷抗凍劑組。這是因為南極磷蝦酶解產(chǎn)物中含有小分子肽能夠與水結(jié)合,增強凍結(jié)過程中水的穩(wěn)定性,有效提高牡蠣肉持水能力。

圖7 不同凍藏時間下各處理組牡蠣肉解凍失水率的變化Fig.7 Changes of thawing water loss rate of oyster meat in each treatment group under different freezing time注:與空白對照組相比,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)；圖8～圖10同。

2.5.2 凍藏過程中各處理組牡蠣肉鹽溶性蛋白含量變化 鹽溶性蛋白是肌肉蛋白質(zhì)的主要組成部分,因此鹽溶性蛋白可以反映牡蠣肉蛋白質(zhì)的特性,其含量越低表示蛋白質(zhì)變性程度越大[29]。隨著凍藏時間的延長,牡蠣肉鹽溶性蛋白含量變化如圖8所示,凍藏5 d時,牡蠣肉鹽溶性蛋白含量下降劇烈,各處理組之間無顯著性差異,繼續(xù)凍藏鹽溶液蛋白含量下降趨勢變緩。凍藏25 d后空白對照組樣品鹽溶性蛋白含量為0.55 mg/mL,下降55%,添加量為0.5%含磷抗凍劑組及添加量為5%的酶解產(chǎn)物組鹽溶性蛋白含量分別為0.51、0.77 mg/mL,分別下降58.53%、37.39%,南極磷蝦酶解產(chǎn)物組極顯著高于空白組及含磷抗凍劑組(P<0.01)。這與Yanan[30]研究結(jié)果一致,結(jié)果表明南極磷蝦酶解產(chǎn)物具有一定的抑制牡蠣肉蛋白質(zhì)冷凍變性的效果,在添加量為5%時作用效果優(yōu)于添加量為0.5%的市售含磷抗凍劑。

圖8 不同凍藏時間下各處理組鹽溶性蛋白含量變化Fig.8 Changes of salt soluble protein in each treatment group under different freezing time注：與含磷抗凍劑組相比，Δ表示差異顯著(P<0.05);ΔΔ表示差異極顯著(P<0.01)，圖9同。

2.5.3 凍藏過程中各處理組牡蠣肉中總疏基含量的變化 巰基是蛋白質(zhì)中最為活躍的基團,在凍藏期間,肌球蛋白的冷凍變性導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,從而使其活性巰基暴露被氧化成二硫鍵,造成總巰基含量下降[31]。各處理組牡蠣肉凍藏過程中總巰基含量變化如圖9所示,隨著凍藏時間的增加,牡蠣肉中總疏基含量逐漸減少,表明牡蠣肉蛋白質(zhì)發(fā)生了一定程度冷凍變性。凍藏25 d后,空白對照組總巰基含量下降至0.300×10-5mol/L,下降65.51%;添加量為0.5%的含磷抗凍劑組和添加量為5%南極磷蝦酶解產(chǎn)物組分別下降至0.312×10-5、0.434×10-5mol/L,分別下降64.13%、50.11%,空白組下降程度最大,添加南極磷蝦酶解產(chǎn)物組總巰基含量極顯著高于空白組和含磷抗凍劑組(P<0.01)。結(jié)果顯示,與空白對照組及添加量為0.5%的含磷抗凍劑相比,添加量為5%的南極磷蝦酶解產(chǎn)物總巰基含量下降率最低,抑制效果最好。因此,酶解產(chǎn)物能一定程度抑制牡蠣肉凍藏過程中發(fā)生蛋白冷凍變性。

圖9 不同凍藏時間下各處理組總巰基含量變化Fig.9 Changes of the total sulfhydryl groups in each treatment group under different freezing time

2.5.4 凍藏過程中不同處理組牡蠣肉中Ca2+-ATPase酶活力變化 水產(chǎn)品凍藏過程中由于肌球蛋白頭部巰基的氧化會導致Ca2+-ATPase酶活力下降,測定Ca2+-ATPase酶活力的變化可以監(jiān)測水產(chǎn)品凍藏過程蛋白質(zhì)變性情況[32]。如圖10所示,牡蠣肉經(jīng)過凍藏后,三個處理組樣品的Ca2+- ATPasease酶活力均出現(xiàn)降低。凍藏25 d時,空白對照組由最開始的0.41 μmol Pi/mg prot/h下降至0.05 μmol Pi/mg prot/h,下降幅度為87.8%,添加0.5%含磷抗凍劑組和添加量為5%南極磷蝦酶解產(chǎn)物組分別降至0.11 μmol Pi/mg prot/h,0.12 μmol Pi/mg prot/h,分別下降73.17%、70.73%,含磷抗凍劑及南極磷蝦酶解產(chǎn)物的Ca2+-ATPasease酶活力極顯著高于空白對照組(P<0.01),南極磷蝦酶解產(chǎn)物可以保持牡蠣肉凍藏過程蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,抑制Ca2+-ATPase酶活力下降,能在一定程度上抑制牡蠣在凍藏過程發(fā)生冷凍變性。

圖10 不同凍藏時間下各處理組Ca2+-ATPase活性的變化Fig.10 Changes of Ca2+-ATPase activity in each treatment group under different freezing time

3 結(jié)論

以南極磷蝦為研究對象,對酶解用酶進行篩選得到堿性蛋白酶酶解效果最佳。堿性蛋白酶正交優(yōu)化得到最佳酶解條件為酶解溫度為55 ℃,酶解pH為8.5,加酶量2.6%,酶解時間為5 h,此時水解度為23.85%。此條件下南極磷蝦酶解產(chǎn)物分子量分布100～5500 Da,占總酶解產(chǎn)物的79.69%。將酶解產(chǎn)物按5%比例添加至牡蠣肉中,經(jīng)過凍藏25 d后,添加量為5%的南極磷蝦酶解產(chǎn)物組的牡蠣肉失水率低于空白對照組及添加量為0.5%的含磷抗凍劑組;抑制鹽溶性蛋白含量及總巰基含量下降效果優(yōu)于含磷抗凍劑組;Ca2+ATPase酶活力與含磷抗凍劑組相似,且高于空白對照組。因此南極磷蝦堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對牡蠣肉具有較好的冷凍保護活性,具有開發(fā)成安全高效無磷抗凍劑的潛在前景。