Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化秦巴山區(qū)粉葛中總異黃酮的提取工藝

,2,3,*,2

(1.陜西科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,陜西西安 710021;2.安康學(xué)院醫(yī)學(xué)院,陜西安康 725000;3.安康學(xué)院秦巴中藥資源研發(fā)中心,陜西安康 725000)

粉葛為豆科植物甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth)的干燥根,載于2015版《中國藥典》,具有解肌退熱、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效,臨床主要用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴等癥狀[1]。2005年版藥典將葛根分為野葛和粉葛,野葛中葛根素含量高于粉葛,而粉葛淀粉含量約是野葛的3倍[2]。粉葛是一種藥食兩用植物,異黃酮是粉葛的有效成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等作用,對髙血壓、冠心病和糖尿病等心血管類疾病也具有獨(dú)特療效[3-7]。粉葛提取物作為原料制備的葛根骨康寧顆?？梢灶A(yù)防中老年骨質(zhì)疏松[8],粉葛還可以制備葛粉、葛根口服液、葛根飲料等[9-10]。

近幾年,國內(nèi)外學(xué)者采用了溶劑法、微波輔助萃取法、酶解法、超臨界萃取法等提取葛根中總異黃酮[11-15],對粉葛中總異黃酮的提取工藝的研究未見報(bào)道,并且傳統(tǒng)方法存在耗時(shí)、溶劑使用量大、設(shè)備要求高且工業(yè)生產(chǎn)成本大等弊端,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。而超聲法具有操作簡單、提取時(shí)間短、條件溫和、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[16],有利于總異黃酮的提取和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

秦巴山區(qū)作為葛根的適生地,因其優(yōu)越的生態(tài)環(huán)境,產(chǎn)出的野葛質(zhì)優(yōu)量大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,葛根的儲藏量高于600萬噸[17],且粉葛引種越來越多,因其開發(fā)用途廣、效益高、綜合開發(fā)利用日益受到重視,研究該地區(qū)粉葛中總異黃酮的提取工藝對區(qū)域特色產(chǎn)業(yè)具有十分重要的意義。因此,本文擬采用超聲波輔助乙醇法提取粉葛中的總異黃酮,并以總異黃酮提取得率為評價(jià)指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,以期為秦巴山區(qū)粉葛的資源開發(fā)和合理利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉葛 采自安康市平利縣,洗凈,除去表面泥沙,晾干,切成薄片,于50 ℃烘箱中烘干、粉碎于干燥器中備用;無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 北京索萊寶科技有限公司。

FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;L5S紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;電子天平 北京賽多麗斯儀器系統(tǒng)有限公司;DK-2000-IIIL型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;KH-250DE型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粉葛中總異黃酮的提取 參考常躍興[18]的方法,稱取粉葛粉末三份,每份約1 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入40%乙醇25 mL,稱定重量,在55 ℃下,超聲輔助提取40 min,冷卻至室溫,再稱定重量,用40%乙醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,得測定用粉葛總異黃酮提取液。

1.2.2 粉葛總異黃酮含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.8 mg,于25 mL容量瓶中,用30%乙醇溶解,定容得到232 μg/mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葛根素標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于容量瓶中,各加1 mL 30%乙醇,再加蒸餾水定容至10 mL,搖勻即得。在波長250 nm下用紫外分光光度計(jì)測定吸光度,再以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.07478x-0.0192,R2=0.9994,此方程具有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 粉葛提取液中總異黃酮含量測定 精密吸取1 mL粉葛提取液于25 mL容量瓶中,加入40%乙醇稀釋至刻度,搖勻。在250 nm的紫外分光光度計(jì)波長下測其吸光度,計(jì)算總異黃酮提取得率。

式中:Y為總異黃酮提取得率,%;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程所得總異黃酮濃度,μg/mL;V為提取液體積,mL;m為粉葛粉末的質(zhì)量,g

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇濃度對粉葛總異黃酮提取得率的影響 稱取粉葛粉末,每份約1 g,料液比1∶25,超聲功率100 W,超聲溫度55 ℃,超聲時(shí)間40 min,乙醇濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%的條件下提取總異黃酮,平行做三份,在波長250 nm下測定其吸光度并計(jì)算提取得率。

1.2.3.2 料液比對粉葛總異黃酮提取得率的影響 稱取粉葛粉末,每份約1 g,乙醇濃度40%,超聲功率100 W,超聲溫度55 ℃,超聲時(shí)間40 min,料液比分別為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55條件下提取總異黃酮,平行做三份,在波長250 nm下測定其吸光度并計(jì)算提取得率。

1.2.3.3 超聲時(shí)間對粉葛總異黃酮提取得率的影響 稱取粉葛粉末,每份約1 g,乙醇濃度40%,料液比1∶25,超聲功率100 W,超聲溫度55 ℃,超聲時(shí)間分別為30、40、50、60及70 min條件下提取總異黃酮,平行做三份,在波長250 nm下測定其吸光度并計(jì)算提取得率。

1.2.3.4 超聲溫度對粉葛總異黃酮提取得率的影響 稱取粉葛粉末,每份約1 g,乙醇濃度40%,料液比1∶25,超聲功率100 W,超聲時(shí)間40 min,超聲溫度分別為35、45、55、65及75 ℃條件下提取總異黃酮,平行做三份,在波長250 nm下測定其吸光度并計(jì)算提取得率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) KH-250DE型超聲波清洗器最大功率100 W,所以本文選擇超聲功率為100 W,超聲時(shí)間60 min,最終在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)三個(gè)因素為自變量,以粉葛總異黃酮提取得率為評價(jià)指標(biāo),采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析,優(yōu)化粉葛總異黃酮提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Box-Behnken test design factor levels and codings

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.6、Origin 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對粉葛總異黃酮提取得率的影響 由圖1可知,粉葛總異黃酮得率先隨乙醇濃度增大而升高,乙醇濃度為40%時(shí),總異黃酮提取得率達(dá)到最大,當(dāng)乙醇濃度高于40%時(shí),總異黃酮提取得率反而降低。這可能是因?yàn)橐掖紳舛忍?粉葛中異黃酮未完全浸出,而隨著乙醇濃度的增大,提取液中除異黃酮外的其他成分也被提取出來,從而影響黃酮類物質(zhì)的提取,造成粉葛總異黃酮提取得率的下降[19]。因此,適宜的乙醇濃度為40%。

圖1 乙醇濃度對粉葛總異黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total isoflavones

2.1.2 料液比對粉葛總異黃酮提取得率的影響 由圖2可知,考察了料液比對粉葛總異黃酮提取得率的影響,料液比在1∶15到1∶45這個(gè)范圍內(nèi),粉葛總異黃酮提取得率隨著料液比的增大而升高,當(dāng)料液比1∶45時(shí),總異黃酮提取得率達(dá)到最大,當(dāng)料液比大于1∶45時(shí),總異黃酮提取得率降低?？赡苁且?yàn)榱弦罕忍r(shí),溶劑不能有效浸潤樣品,無法完全提取出黃酮,因而得率低,而料液比過大時(shí),淀粉大量被吸附導(dǎo)致黃酮溢出受阻。也可能是由于超聲波在溶液中傳播時(shí),聲波能量隨著傳播距離的增加急速衰減,因而隨著固液比的增加,體系中總的溶液體積增大,在距離聲源較遠(yuǎn)的距離處,超聲波能量降低,空化能力削弱,不利于黃酮的溶出[20-21]。因此,選用料液比為1∶45是適宜的比例。

圖2 料液比對粉葛總異黃酮得率Fig.2 Ratio of material to liquid ratio of total isoflavones

2.1.3 超聲時(shí)間對粉葛總異黃酮提取得率的影響 由圖3可知，在30～60 min這個(gè)范圍內(nèi),總異黃酮提取得率隨著時(shí)間的延長而增加,當(dāng)時(shí)間超過60 min后,總異黃酮提取得率降低,最佳超聲時(shí)間為60 min。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間延長,總異黃酮逐漸溶于乙醇提取液,得率逐漸增大。而超聲時(shí)間超過60 min,一方面溶劑逸出,另一方面總異黃酮結(jié)構(gòu)可能受到破壞,導(dǎo)致提取得率下降[22-23]。

圖3 超聲時(shí)間對粉葛總異黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total isoflavones

2.1.4 超聲溫度對粉葛總異黃酮提取得率的影響 由圖4可知,隨著溫度的升高,粉葛總異黃酮提取得率也隨著增加,但當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃后總異黃酮提取得率增加幅度不大,當(dāng)溫度超過45 ℃,粉葛總異黃酮提取得率隨著溫度的升高而減少。這是因?yàn)闇囟冗^高,一些熱敏性組分破壞或者溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低而使總異黃酮提取得率降低,影響黃酮的提取[24-25]。因此,實(shí)驗(yàn)選擇45 ℃作為超聲溫度。

圖4 超聲溫度對粉葛總異黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total isoflavones

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化葛根總異黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表1的因素和水平進(jìn)行設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),結(jié)果見表2。包括 17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中12個(gè)析因點(diǎn),5個(gè)零點(diǎn)。

表3 粉葛中總異黃酮提取得率為響應(yīng)值的回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance of total isoflavone extraction rate in powder

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析 采用Design Expert 8.0 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得出乙醇濃度、料液比、超聲溫度三個(gè)因素與粉葛總異黃酮提取得率之間二次回歸方程Y=0.68+0.001225A+0.013B-0.001775C+0.008525AB-0.002025AC+0.002325BC-0.014A2-0.040B2-0.022C2。二次回歸擬合后的回歸方程方差分析如表3所示。

2.2.3 交互影響顯著性分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出各因素關(guān)于粉葛總異黃酮含量的響應(yīng)面三維圖和等高圖如圖5～圖7所示。觀察響應(yīng)面的陡峭程度可以看出,相對于乙醇濃度與超聲溫度,料液比對粉葛總異黃酮提取得率的影響更大,這與表3分析結(jié)果一致。乙醇濃度和料液比，超聲溫度和料液比等高圖接近橢圓,說明各因素的交互影響較為顯著。

圖5 乙醇濃度和料液比對粉葛總異黃酮 提取得率影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.5 Response surface diagram(a)and contour plot(b)of the effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction yield of total isoflavones

圖6 乙醇濃度和超聲溫度對粉葛總異黃酮提取得率影響的響應(yīng)面圖(c)和等高線圖(d)Fig.6 Response surface diagram(c)and contour plot(d)of the effects of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the extraction yield of total isoflavones

圖7 料液比和超聲溫度對粉葛總異黃酮提取得率影響的響應(yīng)面圖(e)和等高線圖(f)Fig.7 Response surface diagram(e)and contour plot(f)of the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the extraction yield of total isoflavones

從圖5～圖7中可以看出響應(yīng)面開口朝下,總異黃酮提取得率隨各因素的變化呈先增加后減少的趨勢,說明此模型存在最大值的穩(wěn)定點(diǎn)。對穩(wěn)定點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果如表4所示。

表4 穩(wěn)定點(diǎn)的規(guī)范分析Table 4 Specification analysis of stable points

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得各優(yōu)化參數(shù)的準(zhǔn)確可靠性,對各影響因素的優(yōu)化值進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]到實(shí)際操作情況,將最佳條件進(jìn)行修正,設(shè)定為乙醇濃度為41%、料液比1∶47、超聲溫度45 ℃。在該條件下平行進(jìn)行3次試驗(yàn),得到粉葛中總異黃酮的平均提取得率為0.68%,與預(yù)測值的相對誤差為0.21%,表明該模型有較好的預(yù)測性能。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇提取粉葛中總異黃酮,以葛根素為對照品,采用紫外分光光度法檢測總異黃酮含量。通過單因素和響應(yīng)面法分析優(yōu)化提取工藝,探討了乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度對總異黃酮提取得率的影響,通過對穩(wěn)定點(diǎn)的規(guī)范分析得到最優(yōu)的提取條件:乙醇濃度為41%、料液比1∶47、超聲溫度45 ℃,在該條件下粉葛中總異黃酮提取得率為0.68%,結(jié)果顯示實(shí)測值與預(yù)測值的相對誤差僅為0.21%,表明該模型可以很好的優(yōu)化粉葛總異黃酮的提取工藝條件,可用于粉葛總異黃酮的工業(yè)化提取。在考察提取時(shí)間中,盡管60 min時(shí)提取得率最高,但40～60 min之間變化不大,考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的能耗和實(shí)際,可選擇超聲時(shí)間為40 min。