響應(yīng)面法優(yōu)化超聲微波聯(lián)合提取杏鮑菇中麥角硫因工藝

莫宇麗,李亞歡,王 艷,胡晶晶,張怡馨,王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

麥角硫因?qū)W名為2-巰基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽,1909年,Tanret C首次從麥角中分離得到麥角硫因,它是一種無色無味的天然氨基酸[1],具有有效的抗氧化[2]、抗炎[3]、細(xì)胞保護(hù)[4]、護(hù)色[5]和抵抗紫外線輻射[6]等功能。作為一種新型的天然強(qiáng)抗氧化劑,麥角硫因在食品添加劑、保健品、化妝品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力,在市場(chǎng)上存在著巨大需求[7-8]。

麥角硫因不能由動(dòng)物機(jī)體或者人體自身合成,主要存在于一些細(xì)菌和真菌中[1]。在合成麥角硫因的微生物中,杏鮑菇、金針菇等常見食用菌中麥角硫因的含量高且具有天然安全性,是制備麥角硫因的良好資源[9-11]。目前,國內(nèi)外對(duì)麥角硫因的研究多集中于功能研究[1-7],提取方面的報(bào)道一般為水或其它溶劑對(duì)常見食用菌的簡(jiǎn)單浸提[12-14]。對(duì)于生物體內(nèi)活性物質(zhì)的提取,合適的工藝條件可大大提高目標(biāo)產(chǎn)物的提取量,縮短提取時(shí)間,減少提取過程中對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的損耗[15-16]。而食用菌麥角硫因的得率亦會(huì)受溶劑、溫度等因素的影響[16]。因此,有必要對(duì)食用菌麥角硫因的提取工藝提取條件進(jìn)行深入研究。本研究以杏鮑菇為對(duì)象,使用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)杏鮑菇中麥角硫因的條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為杏鮑菇麥角硫因的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 取無蟲害、無機(jī)械損傷、大小均一的樣品用于實(shí)驗(yàn),廣東藍(lán)田農(nóng)業(yè)有限公司;麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司;乙醇、甲醇、丙酮(分析純),甲醇、乙腈(色譜純) 廣州叢源試劑公司。

LC2130高效液相色譜儀 上海天美科學(xué)儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 天津比朗實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;XY-8000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海紫裕生物科技有限公司;MAS-Ⅱ微波萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;低溫連續(xù)相變萃取裝置 珠海共同機(jī)械有限公司;JY92-2D超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干燥方式的選擇 對(duì)照組:取100 g新鮮杏鮑菇,使用粉碎機(jī)將其充分粉碎成粉末狀,加入適量的70%乙醇與其充分混勻、溶解,接著8000 r/min離心10 min,取上清液用70%乙醇定容,用HPLC法測(cè)定麥角硫因含量。

熱風(fēng)干燥:取100 g新鮮杏鮑菇放置于烘箱中干燥至恒重(溫度設(shè)置為50 ℃),然后使用粉碎機(jī)將其充分粉碎成粉末狀,加入適量的70%乙醇與其充分混勻、溶解,接著8000 r/min離心10 min,取上清液用70%乙醇定容,用HPLC法測(cè)定麥角硫因含量。

真空冷凍干燥:取100 g新鮮杏鮑菇置于超低溫冰箱12 h迅速降溫冷凍后,進(jìn)行真空冷凍干燥至恒重(冷阱溫度-57 ℃,真空度200 Pa)。然后使用粉碎機(jī)將其充分粉碎成粉末狀,加入適量的70%乙醇與其充分混勻、溶解,接著8000 r/min離心10 min,取上清液用70%乙醇定容,用HPLC法測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2 超聲微波聯(lián)合提取杏鮑菇中麥角硫因的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 液料比的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與70%乙醇分別按照液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g)進(jìn)行混勻,微波處理(400 W,4 min,70 ℃)、超聲處理(500 W,5 min),然后8000 r/min離心10 min,取上清液用70%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.2 乙醇濃度的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末按照液料比50∶1 (mL/g)分別與40%、55%、70%、85%、100%乙醇進(jìn)行混勻,微波處理(400 W,4 min,70 ℃)、超聲處理(500 W,5 min),然后8000 r/min離心10 min,取上清液用相應(yīng)濃度的乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.3 微波功率的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與55%乙醇按照液料比50∶1 (mL/g)進(jìn)行混勻,分別置于微波功率100、200、300、400、500、600、700 W處理(4 min,70 ℃),超聲處理(500 W,5 min),然后8000 r/min離心10 min,取上清液用55%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.4 微波溫度的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與55%乙醇按照液料比50∶1 (mL/g)進(jìn)行混勻,分別置于微波溫度50、55、60、65、70 ℃處理(500 W,4 min),超聲處理(500 W,5 min),然后8000 r/min離心10 min,取上清液用55%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.5 微波時(shí)間的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與55%乙醇按照液料比50∶1 (mL/g)混勻,于微波(500 W,70 ℃)分別處理3、5、10、15、20、25、30 min,超聲處理(500 W,5 min),然后8000 r/min離心10 min,取上清液用55%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.6 超聲功率的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與55%乙醇按照液料比50∶1 (mL/g)混勻,微波處理(500 W,4 min,70 ℃),然后分別置于超聲功率200、300、400、500、600 W處理5 min,最后8000 r/min離心10 min,取上清液用55%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.2.7 超聲時(shí)間的選擇 取2 g真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末與55%乙醇按照液料比50∶1 (mL/g)混勻,微波處理(500 W,5 min,70 ℃),然后500 W超聲分別處理5、10、20、30、40、50 min,最后8000 r/min離心10 min,取上清液用55%乙醇定容,測(cè)定麥角硫因含量。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇中麥角硫因的提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果,固定微波條件500 W、65 ℃、5 min,超聲波處理5 min,選擇液料比(A)、乙醇濃度(B)和超聲功率(C)為試驗(yàn)因素,以麥角硫因含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化,其試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 麥角硫因含量的測(cè)定 利用高效液相色譜法測(cè)定麥角硫因含量[17]。檢測(cè)條件:色譜柱為Phenomenex公司生產(chǎn)的5 μm C18色譜柱(250 cm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為水∶甲醇=98∶2 (V/V),流速為1 mL/min,取20 μL樣品液進(jìn)行上樣,設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取1 mg 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品用10 mL提取溶劑溶解,制成濃度為0.1 mg/mL(100 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品原液,再將原液分別稀釋成75、50、25和5 μg/mL的麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品溶液,標(biāo)準(zhǔn)品和提取液使用以上檢測(cè)條件用HPLC法檢測(cè);以麥角硫因濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo),以峰面積(μAU·s)為橫坐標(biāo),繪制麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為:y=1.80×10-8x+0.0002,R2=0.9995,其中y為麥角硫因濃度,x為峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方式的選擇

由圖1可知,熱風(fēng)處理后提取得到杏鮑菇的麥角硫因含量為(0.11±0.02) mg/g濕重,顯著低于(P<0.05)其它兩種處理方法;而新鮮杏鮑菇和經(jīng)真空冷凍處理后的杏鮑菇干粉中麥角硫因含量分別為(0.21±0.01)、(0.20±0.02) mg/g濕重,二者無顯著差異(P>0.05)。利用熱風(fēng)干燥對(duì)樣品進(jìn)行干燥時(shí),組織部的水分會(huì)迅速蒸發(fā),這會(huì)對(duì)組織結(jié)構(gòu)造成很大的破壞[18],因此熱風(fēng)干燥容易導(dǎo)致杏鮑菇中營養(yǎng)物質(zhì)的損失。新鮮的杏鮑菇含水量高,易發(fā)生腐敗變質(zhì),不耐貯藏,不適于工業(yè)生產(chǎn)。而使用真空冷凍處理后的杏鮑菇含水量降低,并且低溫處理可減少營養(yǎng)成分的損失,對(duì)處理后的材料進(jìn)行充分粉碎后,也可提高麥角硫因在溶劑中的浸出率。故采用真空冷凍干燥對(duì)杏鮑菇進(jìn)行干燥處理。

圖1 干燥方式對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.1 Effect of drying methods on the content of ergothioneine注:不同小寫字母表示具有差異 顯著性(P<0.05),圖2～圖8同。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 液料比的選擇 由圖2可知,隨著加入提取溶劑體積的增大,液料比升高,得到的麥角硫因含量逐漸升高;在液料比50∶1時(shí),其含量達(dá)到最大值,為(2.46±0.21) mg/g干重,顯著高于其它處理組(P<0.05);但其后隨著溶劑體積的增加,其含量顯著減少(P<0.05)。這有可能是由于在液料比50∶1之前,隨著提取溶劑體積的增加,料液間的濃度差逐漸增大,同時(shí)料液彼此間接觸面積更大[19-20],使得更多的麥角硫因浸出;而在液料比50∶1之后,杏鮑菇中麥角硫因的浸出已趨于飽和狀態(tài),故其提取量不會(huì)再上升。而且液料比過大,會(huì)消耗更多的能量和時(shí)間,故選擇液料比為50∶1。

圖2 液料比對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on content of ergothioneine

2.2.2 乙醇濃度的選擇 由圖3可以看出,其它條件相同的情況下,麥角硫因含量在乙醇濃度為40%和55%時(shí)沒有顯著性差異(P>0.05),分別為(2.86±0.03)、(2.93±0.05) mg/g干重,顯著高于其它處理組(P<0.05);然后隨著乙醇濃度的升高,其含量反而急速減少。這可能是因?yàn)辂溄橇蛞蚩扇苡诙喾N溶劑,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到55%時(shí),麥角硫因能最大程度地溶出,而后乙醇濃度升高則有可能促進(jìn)某些脂溶性雜質(zhì)的溶出,抑制了麥角硫因在提取溶劑中的浸出。Nguyen等[16]使用不同濃度的乙醇提取金針菇中的麥角硫因,同樣發(fā)現(xiàn)這兩者不成正比關(guān)系,而是出于一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)。同時(shí)乙醇濃度的提高可一定程度上減少提取液中雜質(zhì)的含量,因此乙醇濃度選擇為55%。

圖3 乙醇濃度對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on content of ergothioneine

2.2.3 微波功率的選擇 從圖4可以看出,麥角硫因的含量隨著微波功率的升高整體呈上升趨勢(shì);在微波功率為500 W時(shí),其達(dá)到最高值,為(2.02±0.03) mg/g干重;繼續(xù)增大功率,其含量緩慢下降,但其差異不顯著(P>0.05)。這有可能是因?yàn)楫?dāng)微波功率達(dá)到一定值時(shí),可以提供足夠的能量來打破細(xì)胞的細(xì)胞壁,使得有效成分可從細(xì)胞中充分浸出[21-22]。但當(dāng)微波功率超過一定的范圍后,則有可能加速麥角硫因的氧化,損耗了溶液中的一部分麥角硫因,使得其含量降低。故微波功率選用500 W。

圖4 微波功率對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.4 Effect of microwave power on content of ergothioneine

2.2.4 微波溫度的選擇 有研究表明使用微波對(duì)物質(zhì)進(jìn)行處理時(shí),溫度的升高可加速細(xì)胞壁的破裂,促進(jìn)活性成分的浸出[23-24]。由圖5可知,在微波溫度50～70 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,麥角硫因含量逐漸增加;當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí),其含量達(dá)到最大值。在本研究中65、70 ℃時(shí)麥角硫因含量分別為(2.72±0.11)、(2.73±0.07) mg/g干重,兩者間無顯著差異(P>0.05),但在70 ℃時(shí)提取液呈沸騰狀態(tài),這會(huì)造成提取液中乙醇的揮發(fā),從而影響麥角硫因的含量,故微波溫度選擇為65 ℃。

圖5 微波溫度對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.5 Effect of microwave temperature on content of ergothioneine

2.2.5 微波時(shí)間的選擇 如圖6所示,在實(shí)驗(yàn)所選的微波處理時(shí)間3～30 min范圍內(nèi),一開始隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng),麥角硫因含量上升,在5 min時(shí)達(dá)到最大值,為(3.21±0.07) mg/g干重。微波處理可在短時(shí)間內(nèi)提供熱量,使細(xì)胞內(nèi)部迅速升溫,促使細(xì)胞快速破裂[23],從而有可能增加了麥角硫因的浸出量。但在5 min后,麥角硫因含量隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)反而下降,這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚淼臅r(shí)間過長(zhǎng),對(duì)麥角硫因的結(jié)構(gòu)造成了一定程度的破壞。故微波時(shí)間選擇為5 min。

圖6 微波時(shí)間對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.6 Effect of microwave time on content of ergothioneine

2.2.6 超聲功率的選擇 由圖7可知,在超聲功率200、300 W時(shí),麥角硫因的含量有所下降,但差異不顯著(P>0.05),超聲功率300～600 W范圍內(nèi),隨著超聲功率的增加,麥角硫因的含量呈逐漸上升趨勢(shì);在500 W時(shí),麥角硫因含量達(dá)最大值(3.07±0.05) mg/g干重;隨后繼續(xù)增加超聲功率,其含量略有降低,但是差異不顯著(P>0.05)。這有可能是由于超聲功率升高,機(jī)械剪切力增強(qiáng),因此細(xì)胞破裂,麥角硫因從細(xì)胞內(nèi)流出,與此同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用可加強(qiáng)物質(zhì)的擴(kuò)散及溶解。但當(dāng)超聲功率過高時(shí),能量過大會(huì)引起溫度的升高,會(huì)使得一些不穩(wěn)定的抗氧化物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[25-26],麥角硫因的結(jié)構(gòu)有可能因此而發(fā)生改變,故選用超聲功率500 W。

圖7 超聲功率對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on content of ergothioneine

2.2.7 超聲時(shí)間的選擇 由圖8可知,當(dāng)超聲波處理5 min時(shí),麥角硫因含量達(dá)到最高,為(3.70±0.08) mg/g干重,顯著高于其它處理組(P<0.05);隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)(10～50 min),麥角硫因含量呈下降趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05)。適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜稍黾欲溄橇蛞虻娜艹?但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),所消耗的能量就會(huì)越多,并且產(chǎn)生的熱量也會(huì)越高,同時(shí)杏鮑菇中的其它成分也會(huì)溶出,這些都有可能使溶出的麥角硫因發(fā)生分解,從而使麥角硫因的含量降低。故超聲時(shí)間選擇為5 min。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)麥角硫因含量的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on content of ergothioneine

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇麥角硫因的提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析 利用Design-Expert中的Box-Benhnken對(duì)麥角硫因的提取進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析,其響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

通過多元回歸分析,得到二次多項(xiàng)式擬合方程為:

Y=-12.87+0.43A+0.15B+0.009C-2.42×10-3AB+1.52×10-4AC+1.92×10-4BC-3.80×10-3A2-1.13×10-3B2-2.95×10-5C2。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,從表3中可以看出,多元二次模型P<0.0001,表明該回歸模型是極顯著的,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;失擬項(xiàng)P=0.0864(P>0.05),不顯著,說明試驗(yàn)誤差小,可以真實(shí)地反映試驗(yàn)的情況;決定系數(shù)R2=0.9800,表明該方程擬合度較好,可以用該模型分析和預(yù)測(cè)麥角硫因的提取量。從顯著性檢驗(yàn)項(xiàng)可以看出,對(duì)于響應(yīng)值即麥角硫因含量,C、AB、BC、A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01),AC影響顯著(P<0.05),A、B影響不顯著(P>0.05)。各因素影響程度從大到小依次為C>A>B,即超聲功率對(duì)提取麥角硫因影響程度最大。

響應(yīng)面曲線和等高線圖可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱和大小。響應(yīng)面曲面彎曲弧度越大,兩因素間交互效應(yīng)越強(qiáng),其相對(duì)應(yīng)的等高線即越橢圓,兩因素間的交互作用越強(qiáng)。圖9～圖11為兩兩因素之間的響應(yīng)面曲線及等高線。由圖9～圖11可知,AB、AC、BC交互作用對(duì)于麥角硫因的提取量的影響均顯著,與方差分析結(jié)果一致。

圖9 液料比和乙醇濃度互作用的響應(yīng)面圖及等高線Fig.9 Response surface curve and contour of the interaction of liquid to material ratio and ethanol concentration

圖10 液料比和超聲功率的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.10 Response surface curve and contour of liquid to material ratio and ultrasonic power

圖11 乙醇濃度和超聲功率的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.11 Response surface curve and contour of ethanol concentration and ultrasonic power

2.3.2 最佳提取工藝條件的確定及驗(yàn)證 通過解回歸方程,得到最佳工藝條件為:液料比48.12∶1、乙醇濃度為53.46%、超聲功率447.87 W,此時(shí)麥角硫因預(yù)測(cè)值為3.78 mg/g干重。為方便實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,對(duì)該條件進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整,取液料比48∶1、乙醇比為53%、超聲功率450 W。使用該調(diào)整條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn),所得的麥角硫因含量為(3.79±0.02) mg/g干重,與預(yù)測(cè)值(3.78 mg/g干重)誤差在1%以內(nèi),證明該結(jié)果合理可靠。

3 結(jié)論

真空冷凍干燥對(duì)杏鮑菇中麥角硫因造成的損失很少,適用于對(duì)杏鮑菇進(jìn)行前處理;采用經(jīng)真空冷凍干燥后的杏鮑菇粉末作為原材料,運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇麥角硫因提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定液料比48∶1、53%乙醇、微波條件(500 W、65 ℃、5 min)、超聲條件(450 W、5 min)為最佳工藝條件,該條件下可從杏鮑菇中提取得到麥角硫因(3.79±0.02) mg/g干重,與預(yù)測(cè)值誤差在1%以內(nèi),得到的二次回歸方程合理可靠,具有一定的可行性。本研究得到的提取方法可為食用菌中麥角硫因的提取提供參考,具有廣闊的應(yīng)用前景。