迷迭香提取物及其包結(jié)物在中式培根中的應(yīng)用

,*,2,*

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院,天津 301700)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)唇形科迷迭香屬植物[1],其含有多種黃酮類物質(zhì),具有一定的抗氧化活性[2-4]。Chipault等[5]認(rèn)為迷迭香提取物(RE)具有廣譜的抗氧化活性,是生產(chǎn)天然抗氧化劑的重要植物資源。姜蕾等[6]研究表明,RE在體外及抑制薩拉米加工過程中脂肪氧化方面顯示了較好的抗氧化活性。張楠楠等[7]報(bào)道將大黃魚于RE復(fù)配液中浸漬處理后可有效改善其貯藏品質(zhì)。付麗等[8]認(rèn)為不同濃度的RE對冷鮮牛肉具有明顯的抗氧化效果。與合成抗氧化劑相比較,雖然RE作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品中具有更好的安全性,但是存在溶解性和化學(xué)穩(wěn)定性差的弊端。為拓展RE在食品中的應(yīng)用范圍,作者在前期研究中[9]制備了RE的β-環(huán)糊精鉀金屬有機(jī)骨架材料包結(jié)物(RE-K-CD-MOF),大大地改善了RE的溶解性和化學(xué)穩(wěn)定性。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,利用LC-MS/MS鑒定了RE的化學(xué)組成,對比了RE與2,6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)和抗壞血酸(VC)的抗氧化活性,并以RE及RE-K-CD-MOF替代化學(xué)合成抗氧化劑處理中式培根,通過研究其腌制過程中脂質(zhì)氧化規(guī)律,探索了RE及RE-K-CD-MOF對脂質(zhì)氧化的影響,為解決中國傳統(tǒng)中式培根等加工過程中表面脂質(zhì)氧化嚴(yán)重,影響產(chǎn)品品質(zhì)和消費(fèi)者購買心理等弊端提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香 購自云南,粉碎后過20目篩備用；無水乙醇 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;BHT 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;VC天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;甲醇(色譜純)、DPPH Sigma試劑公司;過氧化氫 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;檸檬酸 天津市化學(xué)試劑一廠;1,1,3,3,-四乙氧基丙烷 河北百靈威超精細(xì)材料有限公司;屈臣氏蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

G6410A LC-MSD QQQ液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)機(jī)(LC-MS/MS)(配有ZORBAX SB-C18色譜柱4.6 mm×50 mm×1.8 μm) 美國Agilent公司;Multisynth微波反應(yīng)器 意大利Milestone公司;FD5-3冷凍干燥機(jī) 美國GOLD SIM公司;Alpha-1500紫外可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司;LRH-250-S恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展有限公司;WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;AUY120萬分之一電子天平 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RE的提取 按照文獻(xiàn)的方法[9],采用微波輔助提取迷迭香粗提物,并經(jīng)D101大孔吸附樹脂純化、冷凍干燥得到RE粉末。稱取適量純化后RE粉末,用45%乙醇溶液將其配制成2.0 mg/mL RE樣品儲(chǔ)備液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RE-K-CD-MOF的制備 按照文獻(xiàn)的方法[9],采用溶液包覆法以1∶10的芯壁比制備RE-K-CD-MOF,即稱取一定量的K-CD-MOF(參照文獻(xiàn)[9]制得),用蒸餾水將其溶解,在48 ℃下向K-CD-MOF溶液中逐滴滴加純化后迷迭香黃酮溶液,邊滴加邊攪拌1 h后分出包結(jié)物。待包結(jié)物冷卻后放入冷凍干燥機(jī),在-45 ℃和100 mm Hg下冷凍干燥12 h即得RF-K-CD-MOF干燥粉末,于干燥器中(室溫)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RE成分的LC-MS/MS鑒定 色譜流動(dòng)相為0.1%的甲酸(A)和甲醇(B)的混合物,流速為0.3 mL/min,采用梯度洗脫的模式:0～30 min,40%～75% B;30～35 min,75%～75% B。柱溫30 ℃,進(jìn)樣量5 μL(樣品濃度0.2 mg/mL)。質(zhì)譜采用ESI 負(fù)離子模式100～1000 m/z,霧化氣為N2,流速10 L/min噴霧壓力35 psi,碰撞氣體0.15 MPa,離子源350 ℃,毛細(xì)管電壓4 kV。

1.2.4 RE抗氧化活性的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 將濃度為2.0 mg/mL的RE、BHT、VC經(jīng)適當(dāng)稀釋后分別制得濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL的工作液。按照文獻(xiàn)的方法[10],測定RE清除DPPH自由基能力。即將3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL無水乙醇加入10 mL比色管中,避光靜置30 min,測定其在517 nm處的吸光度,記為A1;將3.5 mL無水乙醇和0.5 mL不同濃度RE、BHT、VC溶液分別加入10 mL比色管中,測定其在517 nm處吸光度,記為A0;將3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH的溶液和0.5 mL不同濃度RE、BHT、VC溶液分別加入10 mL比色管中,避光靜置30 min,測定其在517 nm處的吸光度,記為A。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。按照式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

式(1)

1.2.4.2 OH自由基清除能力的測定 由樣品儲(chǔ)備液稀釋分別配制濃度為0.1 mg/mL的RE溶液、BHT溶液和VC溶液作為工作液。按照文獻(xiàn)的方法[10],采用結(jié)晶紫法測定RE清除OH自由基的能力。即在10 mL比色管中依次加入0.3 mL 0.4 mmol/L結(jié)晶紫溶液,2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4溶液和2.0 mL 40 mmol/L H2O2溶液,最后用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至刻度線,搖勻靜置30 min,測定其在580 nm處吸光度值,記為A0;同時(shí),測定不加H2O2時(shí)的吸光度,記為Ab;在加入H2O2之前分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL RE、BHT、VC溶液測其吸光度,記為Ax。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。按照式(2)計(jì)算OH自由基清除率。

式(2)

1.2.5 RE及RE-K-CD-MOF在中式培根中的應(yīng)用

1.2.5.1 試驗(yàn)樣品的制作和取樣方法 將從本地超市購買的五花肉切割成10 cm×10 cm大小,每塊300 g左右。參考文獻(xiàn)[11]并稍作修改,將每塊五花肉先在4 ℃、相對濕度85%的條件下放置3 d,即鹽腌過程,用鹽量為2.5%(w/w,即每100 g五花肉加2.5 g鹽),隨后移入恒溫恒濕箱,溫度從13 ℃升至40 ℃,每隔2 d升高3 ℃,濕度維持在80%～85%之間,即發(fā)酵成熟過程。

鹽腌的同時(shí)進(jìn)行如下處理:對照組(不進(jìn)行任何抗氧化處理);將0.01%、0.02%、0.03%的RE溶液(以乙酸乙酯∶乙醇∶水(3∶3∶4)溶液配制)均勻的涂抹在涂有食鹽的五花肉表面;將0.1%、0.2%、0.3%(w/w)的RE-K-CD-MOF溶液(以乙酸乙酯∶乙醇∶水(3∶3∶4)溶液配制)均勻的涂抹在涂有食鹽的五花肉表面(由方法1.2.2可知,RE-K-CD-MOF是以1∶10的芯壁比制得,即此處0.1%、0.2%、0.3%的RE-K-CD-MOF溶液中提取物含量等同于0.01%、0.02%、0.03%的RE溶液中提取物含量)。

抽樣工藝點(diǎn):原料、第3 d(鹽腌3 d結(jié)束)、第12 d(發(fā)酵中期)、第17 d(成熟中期)、第22 d(成熟結(jié)束)。每個(gè)工藝點(diǎn)隨機(jī)抽取3塊五花肉,取出后放于-20 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 加工過程中過氧化值(POV)和丙二醛(MDA)的測定 按照GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》進(jìn)行測定。即稱取試樣2～3 g(精確至0.001 g),置于250 mL碘量瓶中,加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液,輕輕振搖使試樣完全溶解。

表1 迷迭香提取物成分鑒定結(jié)果Table 1 Identification of components in rosemary extract

注:*：二氫丁香苷、木犀草素-5-O-葡萄糖醛酸苷和木犀草素-3′-O-葡萄糖醛酸苷根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12-16]和圖譜解析確定。

準(zhǔn)確加入1.00 mL飽和碘化鉀溶液,塞緊瓶蓋,并輕輕振搖0.5 min,在暗處放置3 min。取出加100 mL水,搖勻后立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的碘,滴定至淡黃色時(shí),加1 mL淀粉指示劑,繼續(xù)滴定并強(qiáng)烈振搖至溶液藍(lán)色消失為終點(diǎn),記錄消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。每次測定重復(fù)三次。

參考GB 5009.181-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測定》并稍作修改,即稱取樣品5 g(精確到0.01 g)置于100 mL具塞錐形瓶中,準(zhǔn)確加入50 mL三氯乙酸混合液,搖勻,加塞密封,置于恒溫振蕩器上50 ℃振搖30 min,取出,冷卻至室溫,于4 ℃ 2000×g條件下離心10 min。準(zhǔn)確移取上清液5 mL置于25 mL具塞比色管內(nèi),另取5 mL三氯乙酸混合液作為樣品空白,分別加入5 mL硫代巴比妥酸(TBA)水溶液,加塞,混勻,置于90 ℃水浴內(nèi)反應(yīng)30 min,取出,冷卻至室溫,于532 nm處測定吸光度。每次測定重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS對清除DPPH自由基、OH自由基實(shí)驗(yàn)及加工過程中POV、MDA的變化等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RE的成分分析

采用HPLC-MS/MS技術(shù),對RE的成分進(jìn)行了分析鑒定。利用標(biāo)準(zhǔn)品比對和圖譜解析,從中鑒定出了12種成分,其主要成分為迷迭香酸。具體如表1所示。

2.2 RE抗氧化活性的評(píng)價(jià)

2.2.1 清除DPPH自由基能力 圖1顯示了RE、BHT及VC對DPPH自由基的清除能力?？梢?種樣品對DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而增強(qiáng),當(dāng)RE溶液的濃度增大到1.5 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到84.50%。在同等濃度下,RE對DPPH自由基的清除能力大于BHT小于VC。這是由于RE中的木犀草苷、橙皮苷以及芹菜素-7-O-葡萄糖苷等黃酮類化合物均含有多羥基結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可以與自由基發(fā)生脫氫反應(yīng),自身轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的半醌自由基,從而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng),發(fā)揮抗氧化作用[17],而作為合成抗氧化劑的BHT只含有1個(gè)羥基,而VC含有5個(gè)羥基。

圖1 不同樣品液濃度下DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of sample solution at different concentrations

2.2.2 清除OH自由基能力 樣品RE、BHT及VC對OH自由基的清除能力如圖2所示。由圖2可以看出,3種樣品對OH自由基的清除率隨濃度的增大而增強(qiáng),當(dāng)RE溶液的終濃度增大到5 μg/mL時(shí),清除率達(dá)到51.0%。在同等濃度下,RE對OH自由基的清除能力大于VC小于BHT,這與DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,表明不同的自由基種類以及抗氧化劑與自由基的作用方式等都可能影響抗氧化劑清除自由基的效果。RE中的黃酮類化合物具有4-羰基及5,7位酚羥基等結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)能螯合氧自由基產(chǎn)生過程中所必需的金屬離子,從而起到抗氧化作用[18-19]。而作為合成抗氧化劑的VC雖含有5個(gè)羥基,但不具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),即這5個(gè)羥基均非酚羥基,同時(shí),BHT雖然只含有1個(gè)羥基,但其共軛體系苯環(huán)的存在對抗氧化作用的發(fā)揮起到了增效作用。

圖2 不同樣品液濃度下OH自由基的清除率Fig.2 OH free radical scavenging rate of sample solution at different concentrations

2.3 RE及RE-K-CD-MOF對中式培根脂質(zhì)氧化的影響

2.3.1 RE及RE-K-CD-MOF對中式培根加工過程中POV的影響 不同處理組中式培根在加工過程中POV的變化,如圖3所示。POV值主要是用來衡量脂肪初級(jí)氧化產(chǎn)物的量,尤其是脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的氫過氧化物(HPOD)的量。由圖3可以看出,在加工過程中,對照組及不同處理組的POV均呈上升趨勢,第3 d時(shí)各組POV相差不大,而在發(fā)酵中期直到成熟結(jié)束時(shí),各組POV急劇上升。這是由于前3 d為鹽腌階段,此階段環(huán)境溫度為4 ℃,溫度較低時(shí)五花肉氧化較緩慢,而在第3 d之后五花肉被移入培養(yǎng)箱,溫度以每隔兩天升高3 ℃的速度由13 ℃逐漸升至40 ℃,加工溫度對脂質(zhì)氧化起到加速作用[20-21],且各處理組均較對照組上升緩慢。

圖3 不同處理組中式培根在加工過程中POV的變化Fig.3 Changes of peroxide value in marinate meat of different treatments during processing

由圖3可知,各處理組無論添加RE或RE-K-CD-MOF,其POV都是隨著添加量的增加而降低,且顯著低于對照組(P<0.05),同時(shí),添加量越多,POV降低的程度越大,添加0.03% RE和0.3% RE-K-CD-MOF后,加工結(jié)束時(shí)中式培根的POV由0.082 g/100 g分別降至0.045、0.037 g/100 g,即分別降低了45.1%和54.9%,表明RE及RE-K-CD-MOF對于減緩中式培根的初級(jí)氧化程度是有效果的。添加RE-K-CD-MOF各組POV在加工過程中普遍低于相同濃度下添加RE各組如：添加0.3% RE-K-CD-MOF后,加工結(jié)束時(shí)中式培根的POV由0.045 g/100 g降至0.037 g/100 g,即降低了17.8%,表明對RE進(jìn)行包埋后,其熱穩(wěn)定性增強(qiáng),不易在加熱過程中分解,同時(shí),包合物在壁材的保護(hù)下,具有緩慢釋放RE的特點(diǎn)[22-23],從而延長了RE的抗氧化性能,表現(xiàn)出持久而穩(wěn)定的抗氧化效果。

2.3.2 RE及RE-K-CD-MOF對中式培根加工過程中MDA的影響 不同處理組中式培根在加工過程中MDA的變化,如圖4所示。過氧化物是脂肪氧化的第一個(gè)中間產(chǎn)物,但其性質(zhì)極不穩(wěn)定,可分解為醛、酮、酸等低分子物質(zhì)[24],MDA即為脂肪氧化的終產(chǎn)物之一,它主要是用來衡量脂質(zhì)氧化程度的次級(jí)產(chǎn)物[25]。由圖4可以看出,在加工過程中,對照組及不同處理組的MDA呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第17 d之前各組MDA持續(xù)上升,這是由于在加工過程中氧化中間產(chǎn)物氫過氧化物進(jìn)一步降解的速度加快,導(dǎo)致次級(jí)氧化產(chǎn)物生成速度加快[26],而在成熟結(jié)束時(shí)期MDA減少,這是由于次級(jí)氧化產(chǎn)物MDA與氨基相互作用生成1-氨基-3-氨基丙烯[27],使得MDA呈結(jié)合狀態(tài)而不易被測定出來。

圖4 不同處理組中式培根在加工過程中MDA的變化Fig.4 Changes of malondialdehyde in marinate meat of different treatments during processing

由圖4可知,各處理組無論添加RE或RE-K-CD-MOF,其MDA都是隨著添加量的增加而降低,且顯著低于對照組(P<0.05),同時(shí),添加量越多,MDA降低的程度越大,添加0.03% RE和0.3% RE-K-CD-MOF后,加工結(jié)束時(shí)中式培根的MDA由0.234 mg/kg分別降至0.180、0.149 mg/kg,即分別降低了23.1%和36.3%,表明RE及RE-K-CD-MOF對于減緩中式培根的次級(jí)氧化程度也是有效果的。有研究表明[28-29],迷迭香中的迷迭香酸及迷迭香酚等酚類物質(zhì)可以替代自由基與不飽和脂肪酸結(jié)合,從而抑制脂肪氧化。Lara等[30]研究表明,添加了迷迭香提取物的豬肉餅在冷藏期間,自由基的含量明顯高于對照組,說明迷迭香發(fā)揮了替代自由基與不飽和脂肪酸結(jié)合的作用,表明RE及RE-K-CD-MOF在中式培根加工過程中發(fā)揮了較好的抗氧化作用。添加RE-K-CD-MOF各組MDA在加工過程中同樣表現(xiàn)出普遍低于相同濃度下添加RE各組的效果如：添加0.3% RE-K-CD-MOF后,加工結(jié)束時(shí)中式培根的MDA由0.180 mg/kg降至0.149 mg/kg,即降低了17.2%。

3 結(jié)論

研究顯示，RE是由12種多酚類成分構(gòu)成的混合物,通過對RE及RE-K-CD-MOF在體外和中式培根加工過程中抗氧化活性各項(xiàng)指標(biāo)的測定,表明RE具有良好的清除DPPH自由基和OH自由基的能力。與對照組相比,添加RE及RE-K-CD-MOF可以有效降低中式培根的脂肪氧化水平,且隨著RE及RE-K-CD-MOF添加量的增多,POV和MDA都顯著下降(P<0.05)。而與添加RE組相比,添加RE-K-CD-MOF各組由于壁材對RE的保護(hù)作用,表現(xiàn)出更持久、更穩(wěn)定的抗氧化效果。這種由可食用的(-CD和對人體無害的鉀金屬合成)新型K-CD-MOF材料,有望成為一種被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的綠色材料。本研究將為解決中國傳統(tǒng)中式培根等加工過程中表面脂質(zhì)氧化嚴(yán)重,影響產(chǎn)品品質(zhì)和消費(fèi)者購買心理等弊端提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。