線粒體DNA拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

王珺，王茜怡，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

在人類輔助生殖技術(shù)(ART)中，胚胎形態(tài)學(xué)指標(biāo)和卵裂率是選擇胚胎移植的傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)。雖然通過(guò)這些方法可以改善體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠結(jié)局，但還是有很多移植的胚胎植入失敗[1]。通過(guò)胚胎植入前非整倍性檢測(cè)(PGT-A)，選擇整倍性的胚胎植入，明顯增加了試管嬰兒的活產(chǎn)率，但是，選擇移植的整倍性胚胎即使植入成功，也并非都能獲得持續(xù)妊娠[2]，這表明胚胎發(fā)育潛能也不能僅通過(guò)染色體的狀態(tài)來(lái)評(píng)估。動(dòng)物模型研究表明線粒體與生殖功能密切相關(guān)，在人類輔助生殖領(lǐng)域，研究者也越來(lái)越多地關(guān)注線粒體功能[3-4]。

線粒體通過(guò)其關(guān)鍵的細(xì)胞功能在胚胎發(fā)育和維持胚胎代謝方面起著至關(guān)重要的作用。這些功能包括：維持離子穩(wěn)態(tài)、氨基酸代謝、糖酵解、脂肪酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡調(diào)節(jié)等。早在上世紀(jì)70年代，就有哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞線粒體檢測(cè)的報(bào)道[5]。1981年，Anderson等[6]發(fā)表了人類線粒體DNA(mtDNA)的序列和結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的快速發(fā)展鋪平了道路。在卵母細(xì)胞發(fā)育早期，卵原細(xì)胞包含大約200個(gè)線粒體，隨著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，線粒體數(shù)量持續(xù)增加，排卵中期MⅡ卵達(dá)到頂峰，具有10萬(wàn)個(gè)線粒體，5～55萬(wàn)mtDNA拷貝。成熟卵母細(xì)胞是人類細(xì)胞中線粒體含量最高的細(xì)胞，這可能是由于在卵母細(xì)胞受精和早期胚胎發(fā)育中存在著巨大的能量需求[7]?，F(xiàn)將卵母細(xì)胞受精至胚胎發(fā)育過(guò)程中，線粒體DNA含量與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系綜述如下。

一、卵母細(xì)胞mtDNA含量與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

卵母細(xì)胞的線粒體水平在生殖中扮演著重要的角色。體細(xì)胞中，每個(gè)線粒體內(nèi)含有1～15個(gè)mtDNA拷貝[8]，而卵母細(xì)胞中，一個(gè)線粒體內(nèi)僅包含1個(gè)mtDNA拷貝[5]。休眠在始基卵泡中的卵母細(xì)胞只含有不到1萬(wàn)個(gè)線粒體[9]，排卵中期MⅡ卵可以達(dá)到150萬(wàn)個(gè)線粒體[10]。卵母細(xì)胞是女性體內(nèi)最大的細(xì)胞，成熟卵母細(xì)胞含有較其他體細(xì)胞更多的mtDNA[7]。

Reynier等[11]研究顯示，mtDNA含量減少可能會(huì)引起IVF中卵母細(xì)胞體外受精失敗。與正常受精的卵母細(xì)胞相比，未受精的卵母細(xì)胞mtDNA的含量顯著降低。采用體外成熟的人類卵母細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，減數(shù)分裂時(shí)紡錘體的形成缺失可能導(dǎo)致mtDNA含量低，最終也會(huì)導(dǎo)致胚胎質(zhì)量較差[12]。

有學(xué)者最早證實(shí)MⅡ卵中mtDNA的含量與女性年齡呈負(fù)相關(guān)。女性年齡增加會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞mtDNA數(shù)量的減少及突變率增加，進(jìn)而導(dǎo)致其發(fā)育潛能降低，因此，提出年齡相關(guān)的不孕與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能減弱首要相關(guān)[13]。

高齡患者卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞(CCs)中mtDNA的突變率較高，顆粒細(xì)胞中mtDNA含量的評(píng)估具有預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量的能力[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)IVF的女性黃素化顆粒細(xì)胞中mtDNA存在高比率缺失[16]，而近期研究則并未檢測(cè)到任何缺失[17]，這有待于進(jìn)一步的研究。

二、卵裂期胚胎mtDNA含量與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

人類輔助生殖技術(shù)中，女性成熟卵母細(xì)胞要進(jìn)行體外受精，不能直接進(jìn)行有創(chuàng)性分析，因此，對(duì)人類胚胎mtDNA的含量與輔助生殖結(jié)局的研究逐漸增多。由于mtDNA拷貝數(shù)在胚胎發(fā)育至囊胚之前并不復(fù)制，因此卵裂期mtDNA的含量可反映出受精前卵母細(xì)胞mtDNA的含量[18]。受精卵mtDNA的總量將在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分裂過(guò)程中不斷被稀釋，最終形成每個(gè)卵裂球mtDNA低拷貝的狀態(tài)[19]。而且，由于細(xì)胞質(zhì)的體積不同，每個(gè)卵裂球含有不同比例的mtDNA[20-21]。

早期研究表明，與形態(tài)學(xué)評(píng)分低的胚胎相比，形態(tài)學(xué)評(píng)分高的卵裂期胚胎mtDNA拷貝數(shù)較多[22]。但在相同患者同一枚卵裂期胚胎的不同卵裂球中，卻存在較大的差異。不同的細(xì)胞質(zhì)體積可能是形成差異的主要原因[20-23]。

有研究表明，高齡女性胚胎卵裂球中mtDNA水平較低[24]，但也有研究得出了相反的趨勢(shì)，或至少證實(shí)卵裂球中mtDNA含量與年齡并沒(méi)有相關(guān)性，同時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)卵裂球染色體的狀態(tài)與mtDNA含量的相關(guān)性[25-26]。有研究指出卵裂期胚胎mtDNA含量對(duì)于胚胎植入潛能具有預(yù)測(cè)價(jià)值[27]。卵裂期胚胎培養(yǎng)液非侵入性分析顯示，mtDNA含量與囊胚形成率、胚胎質(zhì)量、植入潛能顯示出正相關(guān)性[28]。

三、囊胚mtDNA含量與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

2015年，F(xiàn)ragouli等[24]與Diez-Juan等[27]首次提出囊胚滋養(yǎng)外胚層mtDNA含量與胚胎發(fā)育潛能的相關(guān)性：低mtDNA含量的囊胚，具有高的植入率。非整倍性囊胚與女性高齡囊胚，mtDNA水平較高，植入率較低[24]?！鞍察o胚胎假說(shuō)”[29]認(rèn)為：mtDNA含量低的胚胎趨于安靜。正常代謝狀態(tài)下的“安靜”囊胚，表現(xiàn)出低的mtDNA拷貝數(shù)，有更大的植入潛能；而能量?jī)?chǔ)備不足的胚胎，會(huì)打破“安靜”狀態(tài)，應(yīng)激啟動(dòng)早期線粒體激活和復(fù)制的補(bǔ)償機(jī)制來(lái)滿足卵裂期增加的能量需求，這使得囊胚期mtDNA含量代償性增加，植入潛能下降。這一假說(shuō)可能能夠解釋先前研究者的發(fā)現(xiàn)[24-27]。

有學(xué)者對(duì)35個(gè)IVF周期的1 500枚整倍性的囊胚進(jìn)行了回顧性分析[30]，觀察到282枚囊胚中，33枚mtDNA高水平的胚胎均植入失敗。研究中有一半的試管嬰兒中心并不存在高水平mtDNA含量的囊胚，另一半中心存在高水平mtDNA含量的囊胚，但其囊胚mtDNA水平升高者占比從1%～27%不等。這樣寬范圍變化的原因尚不清楚，有可能與實(shí)驗(yàn)室條件、促排卵刺激方案等相關(guān)的ART技術(shù)因素有關(guān)。

另有一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究顯示[31]，在移植的199枚整倍性囊胚中，57枚植入失敗，其中有9枚具有較高的mtDNA水平，且這9枚囊胚無(wú)一例成功妊娠。這表明mtDNA評(píng)分與囊胚植入潛能之間存在直接的相關(guān)性，mtDNA評(píng)分至少可以作為一個(gè)負(fù)向指標(biāo)，來(lái)預(yù)測(cè)哪些胚胎不易于移植。mtDNA評(píng)分或許還可以用于IVF實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理，比如，實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行條件好，mtDNA評(píng)分高的囊胚就少，臨床妊娠率就高。

Treff等[32]認(rèn)為形態(tài)學(xué)評(píng)分高的胚胎確實(shí)mtDNA拷貝數(shù)低，但在成功植入胚胎與植入失敗胚胎中，mtDNA含量體現(xiàn)出相似的水平。作者分析，可能是由于樣本量較小或是mtDNA評(píng)估方法不同，導(dǎo)致結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近期大樣本回顧性分析[33]同樣發(fā)現(xiàn)，對(duì)于整倍性囊胚的發(fā)育潛能，mtDNA的預(yù)測(cè)價(jià)值并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是非整倍性囊胚確實(shí)顯示出高水平的mtDNA含量。

近期一項(xiàng)關(guān)于1 600多例囊胚的滋養(yǎng)外胚層活檢細(xì)胞mtDNA研究[34]，發(fā)現(xiàn)非整倍性且質(zhì)量差的囊胚，具有較高mtDNA含量。同時(shí)還提出了新的相關(guān)性指標(biāo)，如：BMI是患者唯一的與mtDNA含量呈正相關(guān)的指標(biāo)；促排卵刺激中，血清黃體酮的濃度對(duì)mtDNA含量有負(fù)向作用，即黃體酮濃度高時(shí)，mtDNA含量低，胚胎質(zhì)量好。

mtDNA檢測(cè)是否可作為臨床胚胎發(fā)育潛能的高效預(yù)測(cè)指標(biāo)仍然是尚未解決的問(wèn)題。而胚胎的發(fā)育潛能也受到諸多因素的影響，這使得探索研究之路更加復(fù)雜。新的研究聚焦于胚胎培養(yǎng)液、顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞等無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)。最新的關(guān)于胚胎培養(yǎng)液mtDNA的前瞻性、雙盲、多中心研究[28]證實(shí)：線粒體DNA與核基因組DNA的比值(mtDNA/gDNA)與胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛能顯著相關(guān)。研究認(rèn)為D3胚胎培養(yǎng)液中mtDNA/gDNA比值可以作為胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估指標(biāo)，可使胚胎評(píng)估的敏感性與特異性達(dá)到92%與65%。這有助于胚胎學(xué)家在胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分相同的情況下，選擇胚胎發(fā)育潛能更好的胚胎植入。

對(duì)于胚胎發(fā)育潛能的研究即令人興奮又富有挑戰(zhàn)。不斷探索無(wú)創(chuàng)的、便捷的、客觀的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)評(píng)估胚胎發(fā)育潛能，是我們下一步努力的方向！