circRNA與卵巢癌的關(guān)系研究進展

丁彩云， 倪觀太

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，是婦科惡性疾病病死率最高的疾病，且發(fā)病率高，每年有超過200 000例的新診斷病例[1]。卵巢癌有多種類型，以上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)最為常見[2]。由于卵巢體積小，無包膜，且處于盆腔深部，EOC在早期常沒有明顯的癥狀，大多數(shù)患者在最初診斷時已處于晚期。因此，對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制進行深入研究，尋找早期診斷標志物和治療靶點迫在眉睫。目前，有研究顯示[3-4]，環(huán)狀RNA (circular RNA，circRNA)充當miRNA分子“海綿”，間接參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。此外， circRNA與卵巢癌相關(guān)性的研究顯示[1]，circRNA在卵巢癌組織中與癌旁組織表達量存在差異，故circRNA有望成為新的腫瘤分子標志物，在卵巢癌的早期診斷與預后評估中發(fā)揮重要作用。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的概念、鑒定方法、形成機制及顯著特征 circRNA是一種廣泛分布于真核生物的新型內(nèi)源性RNA[5]，有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，長度在幾百到幾千 bp 不等，沒有傳統(tǒng)線性 RNA 的5＇帽結(jié)構(gòu)及3＇多聚腺苷酸尾，具有抗RNA降解的能力，更具有穩(wěn)定性。ncRNA通常不參與蛋白質(zhì)合成，在人類基因組中占比超過95%[6]。盡管不攜帶任何編碼序列，但ncRNA在多個疾病學科中得到了廣泛研究，包括如微小RNA(microRNA， miRNA)、小核RNA(small nuclear RNA， snRNA)，長鏈非編碼RNA(long non- coding RNA，lncRNA) 、circRNA。circRNA是ncRNA家族的最新成員，最早發(fā)現(xiàn)于1979年[7]。直到近二十年來，隨著高通量測序、PCR、RNA提取等分子技術(shù)的迅速發(fā)展[8]，已識別circRNA數(shù)量的增多及對其功能研究的深入，學者們得以對其進行廣泛的鑒定和研究。研究者采用幾種識別反式剪接位點的計算算法，包括能夠重建全長circRNA的算法[9]，掌握了circRNA的形成主要有前體mRNA 直接的反式剪接(direct backsplicing)和外顯子跳讀(exon skipping)兩個機制。對反式剪接片段的識別，是鑒定circRNA的一個重要標志。

根據(jù)來源不同，可將circRNAs分為三類：外顯子circRNAs(exonic circular RNAs，ecircRNAs)[10]、內(nèi)含子circRNAs(circular intronic RNAs，ciRNAs)[11]、外顯子-內(nèi)含子共同形成的circRNAs(exonic-intronic circRNAs，EIciRNAvs)[12]。circRNAs具有高度保守性，Memczak S等[3]檢測到1903種小鼠circRNAs，其中81種與人類circRNA相同。circRNA具有組織表達特異性，大多數(shù) circRNA 位于細胞質(zhì)中，可能與circRNA的編碼小肽功能及調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)的形成存在關(guān)聯(lián)；少數(shù)內(nèi)含子circRNA主要分布于細胞核，可參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程。不同的circRNA在不同發(fā)育階段、不同組織中表達量不同，如circHIPK3的表達量在膠質(zhì)瘤細胞中表達量明顯高于正常神經(jīng)細胞[3]。

1.2 circRNA在組織細胞中的作用 circRNA在不同分子生物學途徑中發(fā)揮重要作用，主要有miRNA海綿、結(jié)合蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及編碼小肽[13]?，F(xiàn)研究證明[4]，circRNA主要充當miRNA海綿，通過其上的miRNA結(jié)合位點吸附特定的miRNA，競爭性抑制miRNA的活性，進而調(diào)控靶基因表達[14]。例如Zheng QP等[15]發(fā)現(xiàn)，circHIPK3共有18個結(jié)合位點，可與9 種不同的 miRNA結(jié)合，使得miRNA-124 在惡性腫瘤中與細胞生長相關(guān)的作用會受到circHIPK3的明顯抑制。除“海綿作用”外，circRNA還可通過影響親本基因表達，提高轉(zhuǎn)錄效率，翻譯特定蛋白質(zhì)等方式參與生物學過程的調(diào)控。Burd CE等[16]發(fā)現(xiàn)circRNA形成與pre-RNA的經(jīng)典剪接相互競爭，circRNA形成與線性 RNA呈負性相關(guān)，這表明circRNA可以通過與線性剪接相互競爭來調(diào)控相關(guān)線性RNA的形成而調(diào)節(jié)基因表達[17]。CircRNA可在轉(zhuǎn)錄的起始和延伸發(fā)揮調(diào)控作用，增強轉(zhuǎn)錄。在起始階段，Li ZY等[12]發(fā)現(xiàn)，circRNA可促進起始前復合物的形成。在延伸階段，Zhang Y等[11]發(fā)現(xiàn)circRNAs在其轉(zhuǎn)錄位點積累，并通過與RNA聚合酶Ⅱ相互作用增加親本基因轉(zhuǎn)錄延長。有證據(jù)表明，circRNAs參與調(diào)控幾乎所有的細胞功能，與多種疾病，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等機制關(guān)聯(lián)密切[12]。circRNAs在重要的遺傳途徑中(尤其是腫瘤學)具有巨大的活性，可預見其兩種不同的治療潛力：起miRNA海綿作用的circRNAs的過表達可提高miRNA靶基因的表達，從而沉默腫瘤組織中致癌和高表達的circRNAs，或上調(diào)在腫瘤中低表達、有抑制功能的circRNAs[5]。

2 circRNA與卵巢癌

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，全世界每年有22萬名婦女患有上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)，早期診斷困難，后期發(fā)展迅速， EOC是女性第四大常見死因[18]。信號通路和細胞機制的失調(diào)在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中起著至關(guān)重要的作用[19]。

關(guān)于circRNAs對卵巢癌的調(diào)控作用，它們之間的相關(guān)性是研究人員非常關(guān)注的問題。Ahmed I等[20]首次對臨床卵巢癌中circRNAs的表達進行了分析，他們報道了大量circRNAs在腫瘤樣本中的差異表達；還檢測了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤之間mRNA和circRNA的表達差異；他們恰當?shù)貐^(qū)分了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移病灶中circRNA的RNA外切酶抗性和穩(wěn)定性，而不是mRNA。有趣的是，卵巢癌轉(zhuǎn)移癌中circRNA的信號通路，如STAT、AKT、NF-kB、TGF-B、ILK、HGF和VEGF均下調(diào)，這些通路通常被激活以產(chǎn)生線性RNA和血管生成[4]。

結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、組織特異性強的circRNA 在卵巢癌的早期診斷、發(fā)生、發(fā)展、放化療敏感性及預后方面有重要的研究價值。circRNA 主要發(fā)揮miRNA “海綿”作用，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，通過激活異常增殖信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖周期，參與血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制腫瘤細胞凋亡途徑發(fā)揮作用[21]。特定 circRNA 的上調(diào)或下調(diào)與腫瘤放化療敏感性相關(guān)，某些 circRNA 的表達可以預測腫瘤的復發(fā)[22]。

惡性腫瘤細胞常具有無限增殖以及侵襲、遷移的能力。卵巢癌在發(fā)生、發(fā)展過程受到十分復雜的異常調(diào)控。近年來circRNA在卵巢癌中的關(guān)注度越來越高，有望成為新的分子標記物，如 hsa_circ_0061140 通過發(fā)揮 miR-370 分子海綿的作用，上調(diào) FOXM1 的表達，促進卵巢癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移；circ-ITCH 在卵巢癌中發(fā)生表達下調(diào)，作為 miR-145 的分子海綿，削弱其對 Ras p21 蛋白活化子 1(RASA1)表達抑制，從而抑制卵巢癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[23-24]?，F(xiàn)對 circRNA在卵巢癌中的侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力以及預后指標這三個方面進行以下總結(jié)。

2.1 circRNA 參與調(diào)控卵巢癌的增殖和凋亡 不受機體控制、抑制凋亡、無限生長是腫瘤發(fā)生的特點。癌細胞的無限增殖會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，最終引起患者的惡病質(zhì)，是晚期卵巢癌患者死亡的一大因素。惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到遠端部位的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個綜合性生物學過程，常受到多種基因、多種蛋白的調(diào)節(jié)[25]。circRNA 已被證實參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其作用是作為miRNAs海綿或通過與RNA相關(guān)蛋白結(jié)合并形成RNA蛋白復合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，進而影響腫瘤的增殖和凋亡[13，26]。

Luo L等[27]在2018年研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常卵巢上皮細胞，circ-ITCH在4種人上皮性卵巢癌細胞系中均表達下降，分別為SKOV3、A-2780、OVCAR-3和HO-8910，且在SKOV3細胞中下調(diào)最為明顯。CircRNA-ITCH可通過靶向下調(diào)miR-10a表達，進而抑制SKOV3細胞的增殖并促進其凋亡，與腫瘤體積小、FIGO期縮短、OS延長均有關(guān)。Gan XL等[28]研究發(fā)現(xiàn)，circMUC16在EOC組織中的表達量明顯高于正常卵巢組織，且其表達與EOC的分期、分級進展有關(guān)。circMUC16通過吸附miR-199a-5p調(diào)控Beclin1和RUNX1，促進上皮性卵巢癌的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。

另外，Li QH等[29]發(fā)現(xiàn)，circ-CSPP1在卵巢癌組織中表達顯著上調(diào)，且 miR-1236-3p為circ-CSPP1的靶點，二者表達呈顯著負相關(guān)。相關(guān)報道顯示[29]，體外沉默circ-CSPP1的卵巢癌細胞在RNA和蛋白質(zhì)水平上都顯著降低了鋅指E盒結(jié)合同源異形盒1(zinc-finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)的表達，并且EMT相關(guān)標記(E-cadherin和N-cadherin)隨著ZEB1的表達而變化。Circ-CSPP1的沉默也導致基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)表達降低，兩者均與腫瘤發(fā)生有關(guān)。Li QH等[29]的實驗表明circ-CSPP1通過充當miR-1236-3p海綿，損害miR-1236-3p對ZEB1的抑制作用，從而促進EMT和卵巢癌的發(fā)育。

Zhang MY等[30]也通過qRT- PCR 等相關(guān)實驗操作技術(shù)，對正常的卵巢組織和卵巢癌組織中 circRNA進行檢測，結(jié)果顯示hsa-circ-0051240在卵巢癌組織中表達明顯上調(diào)，并可通過miR637/KLK4軸對卵巢癌細胞進行調(diào)控，導致卵巢癌細胞的增殖和遷移、侵襲能力發(fā)生明顯增強。Bao LP等[31]研究發(fā)現(xiàn)，VPS13C-has-circ-001567在卵巢癌組織中高表達，在卵巢癌SKOV3和OV-1063中，敲除該基因后，使得G1期細胞周期停滯，S1期細胞百分率下降促進細胞的凋亡，抑制其增殖，降低了SKOV3和OV-1063細胞的侵襲能力。

2.2 circRNA與卵巢癌的診斷和預后 近年來，circRNAs被認為是某些類型腫瘤的生物標志物[32-33]。例如，circRNA通過IL6-STAT3途徑調(diào)節(jié)胰腺癌增殖[34]；上調(diào)的circRNA UBAP2充當miRNA-143的海綿，促進骨肉瘤的進展[35]；circRNA-MYLK是一種促進膀胱癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)源性RNA，且circRNA-MYLK水平與膀胱癌患者的分期和分級有關(guān)[36]。

circRNA在卵巢癌細胞株以及卵巢癌患者的組織樣本和血漿中的表達，以及相應(yīng)的病理類型，提示circRNA或可成為卵巢癌的一種新的診斷與預后標志。Ning L等[37]對比54例卵巢癌組織和與之配對的正常卵巢組織，進行了circRNA序列測定和qRT-PCR等操作驗證，發(fā)現(xiàn)circBNC2、circEXOC6B、circFAM13B、circN4BP2L2和 circRHOBTB3 在卵巢癌組織中的表達明顯下調(diào)，而 circCELSR1 的表達顯著上調(diào)。此外，Ning L等[37]應(yīng)用非參數(shù)檢驗、秩和檢驗等統(tǒng)計學方法，確定差異表達的circRNAs與EOC的各種臨床病理特征之間的關(guān)系。其分析結(jié)果表明，低水平的 circBNC2 與發(fā)病年齡較低、FIGO 分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和大量腹水有關(guān)；低水平的circEXOC6B 和 circRHOBTB3 與發(fā)病年齡較低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；低水平的 circFAM13B 和circN4BP2L2 與發(fā)病年齡較低、FIGO 分期高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；高水平的 circCELSR1 與 FIGO 分期高、大量腹水及殘留腫瘤直徑較大相關(guān)；高水平的circN4BP2L2 與相對較長的無進展生存期(PFS)相關(guān)；高水平的 circEXOC6B 與相對較長的總生存期(OS)相關(guān)。以上結(jié)果顯示circEXOC6B與circN4BP2L2有預測卵巢癌患者預后的意義，或可作為卵巢癌患者新的預后標志物。

circHIPK3包含miRNA-558的兩個關(guān)鍵結(jié)合位點，并且可以吸附海綿miR-558來抑制heparanase(HPSE)的表達[38]。Liu N等[2]檢測了69對上皮性卵巢癌組織樣本和匹配的鄰近非癌組織樣本，qRT-PCR分析結(jié)果顯示EOC組織中circHIPK3的表達明顯高于鄰近的非癌組織。在4種卵巢癌細胞系(A2780、HO-8910、SKOV3和CAOV3細胞)中，circHIPK3的表達也顯著升高，提示circHIPK3的過表達，可能與腫瘤的進展有關(guān)。Lin N等[2]進一步研究發(fā)現(xiàn)，EOC患者中高表達的circHIPK3與淋巴結(jié)浸潤和晚期FIGO分期呈正相關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、腫瘤位置等無相關(guān)性。他們采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析circHIPK3表達與ECO預后的關(guān)系，提示相較于circHIPK3表達量較低的ECO患者，circHIPK3表達量較高的病人PFS和OS明顯下降；多因素Cox分析顯示，高外周血circHIPK3是EOC患者獨立的不良預后因素。因此，其表明circHIPK3作為EOC的預測因子，具有重要的臨床價值。

經(jīng)circRNA表達譜和生物信息學分析，證實circLARP4在胃癌中高表達，通過與miRNA-424結(jié)合抑制胃癌細胞的增殖、侵襲，并與胃癌患者的病理分期和不良預后有關(guān)[5]。然而，circLARP4在卵巢癌中的潛在臨床作用尚不清楚[39]。Zou T等[40]采用qRT-PCR檢測78例卵巢癌組織及癌旁正常組織，發(fā)現(xiàn)circLARP4在卵巢癌組織中的表達明顯低于相應(yīng)的對照組。追蹤患者病情發(fā)展，應(yīng)用卡方檢驗評估circLARP4的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法評估生存曲線，建立多因素Cox分析模型來做腫瘤預后分析，結(jié)果顯示，circLARP4的表達與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)；circLARP4為卵巢癌預后的獨立危險因素；circLARP4的低表達與卵巢癌患者預后不良相關(guān)。因此，circLARP4表達下調(diào)，或可成為卵巢癌預后的潛在生物標志物。

以上研究表明 circRNA 與卵巢癌之間關(guān)系密切，與卵巢癌患者的PFS和OS等預后指標存在密切關(guān)聯(lián)，或可作為卵巢癌新的診斷與預后指標。

3 小結(jié)與展望

circRNA是一種新類型的非編碼RNA，在細胞中含量豐富，因其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性、序列高度保守性、組織和時空特異性等特征。circRNA是一類新的生物分子，目前該研究領(lǐng)域主要有三個方向：①細胞中circRNA的表達與分布情況；②傳統(tǒng)線性RNA與circRNA的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生方式；③circRNA的功能。circRNA 的各種功能正逐漸被揭示，其中，circRNA作為miRNA 分子海綿的作用，與一系列疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

circRNA在惡性腫瘤中的作用也已成為當前的研究熱點，有望成為惡性腫瘤的新型診斷標記物、分子治療靶點和預后評估指標。雖然目前關(guān)于circRNA與卵巢癌的研究取得了一定的成果，但報道文獻數(shù)量較少，仍有許多問題亟待進一步探索與挖掘，如 circRNA 與 卵巢癌EMT的發(fā)生，circRNA 與其下游作用靶點之間的關(guān)系，參與卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖的調(diào)節(jié)機制，與卵巢癌的細胞病理分型、預后調(diào)節(jié)以及基因診斷的關(guān)系等。這些問題為今后研究 circRNA與卵巢癌的關(guān)系提供新思路。