微生物降解角蛋白機制及角蛋白酶應(yīng)用研究進展

張 榮 ，凌曉寧 ，李昆太

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

近年來，由于全球人口增多伴隨著禽肉制品的大量消費，家禽業(yè)產(chǎn)生的羽毛廢棄物越來越多，根據(jù)Alltech 全球飼料調(diào)查，2018年肉雞飼料產(chǎn)量為 3 億 t，估計可生產(chǎn)約 2 億 t 雞肉和 1000 多萬 t 雞毛[1]。這不僅僅會浪費大量的蛋白質(zhì)資源，而且還會引起各種各樣環(huán)境方面的問題，進而危害人體健康。角蛋白廢棄物作為可再生利用的生物資源，可以作為不同領(lǐng)域的使用材料。如羽毛富含氨基酸，是肥料和飼料的寶貴來源[2]。已有研究結(jié)果表明，大量細(xì)菌和真菌通過分泌角蛋白酶來降解羽毛，可以將羽毛轉(zhuǎn)化為生物肥料和動物飼料等增值產(chǎn)品應(yīng)用于家禽工業(yè)，既能降低了成本又能保護環(huán)境[3]。由于羽毛的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在未適當(dāng)處理的情況下被釋放到環(huán)境中，容易成為污染源之一[4]。未經(jīng)處理的羽毛會使多種致病微生物排放各種污染物，如氧化亞氮、氨氣和硫化氫，嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人類的健康。因此，如何合理處理和利用羽毛引起人們的廣泛關(guān)注。 本文著重介紹了微生物降解角蛋白機制研究及角蛋白酶的應(yīng)用，為今后角蛋白酶研究打下堅實的基礎(chǔ)。

1 角蛋白的結(jié)構(gòu)

角蛋白作為一種難降解的結(jié)構(gòu)蛋白，是繼纖維素和幾丁質(zhì)之后的第三類聚合物[5]。根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)差異可以分為 α-角蛋白和 β-角蛋白[6-7]。一般情況下，動物毛發(fā)中的角蛋白為 α-角蛋白，具有 α-螺旋結(jié)構(gòu)，直徑為 7～10 nm，分子量在 40～60 ku [8]，家禽羽毛、蹄和角中的角蛋白為 β-角蛋白，其結(jié)構(gòu)為 β-折疊[9]，二硫鍵含量較高[10]，直徑為 3～4 nm，其分子質(zhì)量在 10～12 ku [10-11]。α-螺旋和 β-折疊會以多種形式結(jié)合，形成角蛋白的超螺旋結(jié)構(gòu)，再加上二硫鍵、疏水鍵和氫鍵等鍵的強相互作用，導(dǎo)致角蛋白分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不容易被降解[12-14]。

2 角蛋白的加工工藝研究

角蛋白具有較高的經(jīng)濟利用價值，但其分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不容易被常規(guī)方式降解。目前，降解角蛋白的方法主要有物理、化學(xué)和生物降解法[15]。

2.1 物理法

物理降解法主要分為高溫水解法和膨化法。在飼料生產(chǎn)中經(jīng)常使用高溫水解法降解角蛋白，首先是把羽毛清洗干凈、曬干，并放置在高壓鍋內(nèi)，在高溫高壓的處理下，使其干燥、粉碎，最后過篩，就得到羽毛粉。在該流程中控制好溫度、壓力和時間等條件，可以有效保證羽毛粉的營養(yǎng)價值，但大多數(shù)情況下只能得到分子量較低的蛋白和多肽混合物，并且會破壞產(chǎn)品中的甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等氨基酸的結(jié)構(gòu)[16-17]。

膨化法是對羽毛進行切割、擠壓、加熱，使其熔化，并立即將其降低到常溫常壓，從而破壞角蛋白的結(jié)構(gòu)，獲得最終產(chǎn)品。雖然該方法操作簡單，但在膨化過程過程中溫度和壓力的劇烈變化，容易破壞二硫鍵，降低半胱氨酸含量，且成本高、能耗高，在實際生活中應(yīng)用不廣泛[18]。

2.2 化學(xué)法

化學(xué)降解法是指加入化學(xué)試劑使角蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵斷開，角蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)被破壞，將不可溶的角蛋白分解為可溶的多汰、氨基酸組分?；瘜W(xué)降解法主要分為酸水解和堿水解。

酸水解法是將蛋白質(zhì)和酸混合后加熱水解，破壞角蛋白中二硫鍵和肽鍵，使角蛋白釋放氨基酸，最終得到氨基酸產(chǎn)物的方法，主要應(yīng)用于飼料和氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中[19]。堿水解法一般使用氫氧化鈉、氫氧化鈣等強堿試劑破壞角蛋白結(jié)構(gòu)后得到氨基酸溶液[20]。 堿水解法導(dǎo)致胱氨酸、半胱氨酸和精氨酸的損失，并將 L-氨基酸轉(zhuǎn)化為 D-氨基酸，這些氨基酸不能被動物消化?；瘜W(xué)降解法不僅會破壞角蛋白中的部分氨基酸，還會產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水，而且處理工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，在實際操作中有一定的局限性[21]。

2.3 生物降解法

利用微生物產(chǎn)生的角蛋白酶在溫和條件下對角蛋白廢棄物進行處理，成為近年來一種高效、低能耗和環(huán)保的降解方式[17]。生物降解法分為酶法和微生物降解法。

酶法是利用角蛋白酶將角蛋白廢棄物水解成許多短肽，得到最終產(chǎn)品的一種方法。該方法操作條件溫和、綠色環(huán)保、產(chǎn)品消化率高、穩(wěn)定性好，但成本較高，在實際生活中應(yīng)用不廣泛[7]。

微生物降解法是通過某些微生物發(fā)酵產(chǎn)生角蛋白酶作用于角蛋白，從而得到降解產(chǎn)物的方法。與物理和化學(xué)方法相比不僅反應(yīng)條件溫和，角蛋白的營養(yǎng)價值損失較小、氨基酸的利用率增高，而且不會產(chǎn)生大量廢棄污染物。與酶法相比不僅成本低，而且還能產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)[22]。與理化方法相比，反應(yīng)條件溫和，角蛋白營養(yǎng)價值損失小，氨基酸利用率提高，沒有產(chǎn)生大量的廢污染物。與酶法比較不僅成本低，而且能產(chǎn)生多種營養(yǎng)素[22]。

3 微生物降解角蛋白機制研究

迄今為止，微生物產(chǎn)生的角蛋白酶降解角蛋白的機制尚未建立。一般認(rèn)為，隨著微生物的生長和代謝，角蛋白逐漸被降解為氨基酸、肽和能量等物質(zhì)[23]。該過程包括 3個基本步驟：變性、分解和轉(zhuǎn)氨基作用[24]。

3.1 變性：破壞二硫鍵

角蛋白中含有大量不易變性的二硫鍵，因此，為了降解角蛋白，應(yīng)首先破壞這些二硫鍵，以松開角蛋白的結(jié)構(gòu) [25]。目前對二硫鍵破壞機理的研究可歸納為 4種類型：生物膜電位 [26]、機械壓力 [27]、硫分解[28]和酶解理論[29]。

3.1.1 生物膜電位理論生物膜電位理論認(rèn)為，細(xì)菌對角蛋白的分解可以通過其表面的膜結(jié)合氧化還原系統(tǒng)進行，該氧化還原系統(tǒng)含有二硫鍵還原酶和 NADH 生產(chǎn)系統(tǒng)。 NADH 生產(chǎn)系統(tǒng)可以提供持續(xù)的還原力來打開二硫鍵，維持細(xì)胞氧化還原平衡，促進角蛋白降解。Ramnani 等[30]發(fā)現(xiàn)，角蛋白酶和具有二硫化物還原活性的細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)都不能完全降解羽毛，而活細(xì)胞的存在對降解非常重要。在降解過程中，細(xì)胞粘附在羽毛表面，由于細(xì)胞分泌的還原劑不斷供應(yīng)，使角蛋白不斷降解，說明活細(xì)胞與羽毛的接觸有利于降解。

生物膜電位理論依賴于活細(xì)胞的活性來產(chǎn)生無限的還原能力來破壞二硫鍵，因為細(xì)胞外分泌的角蛋白酶或角蛋白酶加上其他細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)不能有效地自行降解角蛋白[31]。然而，目前對這一理論的研究還比較少，研究人員很難確定二硫鍵是如何被還原的。

3.1.2 機械（物理）壓力理論機械壓力現(xiàn)象通常發(fā)生在能夠產(chǎn)生菌絲體的微生物中。菌絲生長會產(chǎn)生機械效應(yīng)，切割角蛋白分子，暴露角蛋白分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，有利于更好地發(fā)揮角蛋白的作用 [32]。雖然菌絲生長所帶來的機械壓力是破壞角蛋白致密結(jié)構(gòu)的主要力量，但角蛋白的溶解是角蛋白酶作用的結(jié)果 [33]。

在某些角蛋白降解真菌中，菌絲體的機械破壞發(fā)生在角蛋白酶產(chǎn)生之前，菌絲體的生長速度與角蛋白的降解程度呈正比。因此，菌絲聚集產(chǎn)生的壓力和生長過程中產(chǎn)生的滲透效應(yīng)被認(rèn)為是角蛋白降解機制的物理效應(yīng)[34]。

3.1.3 硫解作用理論二硫鍵維持角蛋白的穩(wěn)定，它的斷裂有利于角蛋白降解，需要堿性環(huán)境或還原劑才能破壞二硫鍵[35]。如化學(xué)還原劑或生物酶，其功能與二硫化物還原酶相似。硫解理論涉及微生物在新陳代謝過程中分泌亞硫酸鹽，打破角蛋白二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。在微生物降解羽毛的早期階段，可以檢測到含有巰基和巰基半胱氨酸殘基的肽。隨著降解過程的進行，降解液中亞硫酸鹽和硫醇化合物的含量會逐漸降低，而硫酸鹽含量會逐漸增加[36]。由于角蛋白降解過程中大量二硫鍵的破壞，在角蛋白降解微生物中發(fā)現(xiàn)了高濃度的半胱氨酸。因為高濃度的半胱氨酸對細(xì)胞有毒，降解角蛋白的微生物必須能夠平衡半胱氨酸水平[37]，微生物會將半胱氨酸轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽，進而促進角蛋白酶活性和角蛋白降解。

3.1.4 復(fù)合酶理論利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，研究人員從角蛋白水解液中分離、純化出不同種類的角蛋白酶。但發(fā)現(xiàn)角蛋白不能被純角蛋白酶水解，除非存在二硫鍵還原酶或類似的還原力[38]。因此，二硫鍵還原酶在角蛋白的降解過程中起著決定性的作用，而角蛋白在整個降解過程中是不可缺失的，需要不斷的分泌[39]。角蛋白酶是一種復(fù)合酶，包括二硫還原酶、肽酶和水解酶，角蛋白中的二硫鍵被二硫鍵還原酶還原，還原后的角蛋白被角蛋白酶進一步水解成短肽或氨基酸等物質(zhì)。

3.2 水解作用：角蛋白酶水解

當(dāng)角蛋白的致密結(jié)構(gòu)被破壞時，通過各種變性方法，角蛋白降解菌株開始分泌角蛋白酶進一步降解松散的角蛋白，將結(jié)構(gòu)被破壞的多肽鏈進一步水解成小分子多肽甚至氨基酸小分子。角蛋白酶是一種特異降解角蛋白的蛋白水解酶，這意味著它比其他蛋白酶對角蛋白底物更敏感。 角蛋白酶具有廣泛的底物，能完全溶解許多可溶性和不溶性蛋白質(zhì)，如酪蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白、球蛋白、羊毛和羽毛[40]。水解過程受溫度、pH 值、還原劑、金屬離子和酶抑制劑等多種因素的影響。 此外，大多數(shù)角蛋白酶在 40～60 ℃和中性至堿性 pH 下顯示出最佳活性，很少是酸性蛋白酶。

3.3 轉(zhuǎn)氨基作用

小分子多肽氨基和氨基酸小分子在轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的作用下完全水解，生成硫化物和銨鹽或氨氣。由于轉(zhuǎn)氨基作用和二硫鍵還原釋放的硫巰基的存在，大多數(shù)角蛋白酶釋放大量的銨鹽，從而增加溶液的堿度[40]，能夠降解角蛋白的微生物菌株正在不斷開發(fā)中[41]。然而，這些微生物降解角蛋白的機理尚未完全闡明，嚴(yán)重阻礙了角蛋白廢棄物的可持續(xù)利用，因此，需要廣大學(xué)者進一步研究。

4 角蛋白酶的應(yīng)用

4.1 角蛋白酶在制革工業(yè)中的應(yīng)用

在制革工業(yè)中，傳統(tǒng)制造皮革的方法是使用石灰、含硫化合物和其它直接脫毛劑，化學(xué)脫毛工藝會產(chǎn)生大量有毒廢物，污染水，土壤和大氣，并導(dǎo)致嚴(yán)重的人類健康問題。每公斤皮革加工使用約 35～40 L的水，該過程不僅會產(chǎn)生大量廢水廢氣，造成巨大的水污染和浪費，還會造成皮革質(zhì)量受損[42]。角蛋白酶在制革過程中的應(yīng)用，取代了傳統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，不僅具有降低皮革成本、節(jié)能、環(huán)保、提高皮革質(zhì)量的優(yōu)點，而且可以使毛皮中的膠原蛋白變得松散，使皮革更加柔軟舒適[43]。從Bacillus cereusandPseudomonassp.提取的角蛋白酶不僅可以提供更好的脫毛效果，而且可以提供更好的皮革質(zhì)量[44]。Kalaikumari 等[45]利用Bacillus paralicheniformisMKU3 菌株產(chǎn)的角蛋白酶加入到脫毛過程中，脫毛效果明顯，是突出的皮革脫毛劑，其對皮革沒有損害作用。

此外，酶促脫毛可最大程度地減少制革廠常用的有害化學(xué)物質(zhì)（硫化物，石灰和胺）的依賴，通過降解家禽糞羽毛產(chǎn)生的角蛋白酶可以成為皮革行業(yè)化學(xué)脫毛的替代方法，從而可以通過生物修復(fù)防止環(huán)境污染。

4.2 角蛋白酶在飼料和肥料中的應(yīng)用

含有硫和氨基酸的有機肥料已被公認(rèn)能促進植物的新陳代謝。鑒于這一事實，角蛋白水解物是一種廉價的蛋白質(zhì)，含有這些成分，使它們成為有前途的生物肥料。將角蛋白廢棄物進行農(nóng)業(yè)堆肥，利用微生物使氮肥緩慢釋放，可以作為豐富的氮源補充劑來支持植物生長，改善土壤質(zhì)地[46]。Pseudomonas otitisH11 可以產(chǎn)生寡肽和各種氨基酸，富含寡肽的水解產(chǎn)物可以用作功能性寡肽提取的來源，也可以用作功能性飼料補充劑[47]。金桿菌屬產(chǎn)生的角蛋白酶用于改善香蕉植株中的氮，促進植物的根和芽的生長[48]。羽毛分解產(chǎn)生的角蛋白酶具有切割 β-角蛋白結(jié)構(gòu)的親和力，因此可以降解 β-折疊密度大的朊蛋白，消除飼料中的朊蛋白污染，用于生產(chǎn)安全的飼料，在一定程度上緩解動物飼料蛋白供求的緊張形勢[49]。

4.3 角蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用

研究表明，角蛋白酶具有使洗滌劑穩(wěn)定的特性以及對不同污漬具有清潔能力[50]。Bacillus aeriusNSMk2 所產(chǎn)的角蛋白酶顯示出對鹽度的出色穩(wěn)定性，并且被發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)商業(yè)洗滌劑兼容，可以有效去除衣服上的巧克力，血液和蛋清蛋白污漬[51]。芽孢桿菌 TKB2 產(chǎn)生的角蛋白酶作為添加劑加入到洗滌劑中，可提高其去污能力，并且不會破壞衣物，產(chǎn)生的洗滌廢水不會污染環(huán)境[52]。除了用于洗滌劑外，角蛋白酶還用做排水溝清潔劑中的添加劑[53]。角蛋白酶除了用于清潔劑外，還用作下水道清潔劑中的添加劑[53]。含磷洗滌劑廢水流入河道，導(dǎo)致水體磷含量增加，水質(zhì)富營養(yǎng)化，藻類大量生長，破壞正常生態(tài)平衡。因此，使用含角蛋白酶的洗滌劑，對環(huán)境影響小，效率高，是未來的發(fā)展趨勢[54]。

4.4 角蛋白酶在醫(yī)藥和化妝品中的應(yīng)用

以角蛋白酶為基礎(chǔ)的藥物治療痤瘡具有很高的療效，痤瘡?fù)ǔ１憩F(xiàn)為皮膚中的皮脂腺感染，造成這種情況的主要原因是角質(zhì)形成過多阻塞了皮脂腺，導(dǎo)致出現(xiàn)紅色丘疹，主要發(fā)生在青少年中。一些藥物已經(jīng)在治療痤瘡的療法中推出了溫和的酶促剝離或活性佐劑。在全球范圍內(nèi)，患有指甲疾病的患者，往往需要長時間的治療，并面臨一個重大的問題——復(fù)發(fā)。使用角蛋白酶可以分解甲蓋的角蛋白，從而使甲蓋松動，增強藥物的滲透性[55]。來自Paecilomyces marquandii產(chǎn)的角蛋白酶被證明可以破壞甲蓋并增強藥物滲透性[56]。

角蛋白酶可以祛除皮膚外層的角質(zhì)，幫助化妝品中的活性成分更容易進入皮膚深層，作用于皮膚深層細(xì)胞。角蛋白酶降解的角蛋白主要是氨基酸和多肽，使皮膚吸收營養(yǎng)物質(zhì)。角蛋白水解物也可用于洗發(fā)水和著色劑等護發(fā)產(chǎn)品中，以防止化學(xué)和環(huán)境對頭發(fā)的損害，提高頭發(fā)質(zhì)量[57]。還可以用角蛋白酶代替常用于脫毛膏中的巰基乙酸鹽，生物脫毛劑具有顯著的脫毛效果，與市售脫毛膏相比，生物脫毛劑顯示出角蛋白酶在化妝品行業(yè)的獨特用途。

5 小結(jié)與展望

羽毛廢棄物是自然界中蛋白質(zhì)含量最高的資源，其利用率很低。應(yīng)用角蛋白酶降解角蛋白處理成本較低、產(chǎn)品更高效、穩(wěn)定、生物轉(zhuǎn)化作為一種低成本、環(huán)境友好的工藝被廣泛接受，具有巨大的發(fā)展?jié)摿涂臻g。有關(guān)角蛋白酶的研究越來越多，它們新的潛在應(yīng)用也不斷被開發(fā)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對蛋白質(zhì)需求的增加，對角蛋白酶降解的機理和方法的研究越來越深入，角蛋白資源的廣泛應(yīng)用，不僅可以緩解我國蛋白質(zhì)飼料資源的短缺，而且可以改善羽毛廢棄物對環(huán)境的污染，具有重要的現(xiàn)實意義和戰(zhàn)略意義。