基于GC-MS技術(shù)研究炮制對白術(shù)芍藥散中揮發(fā)性成分的影響

孫戡平，謝莉，秦昆明，金俊杰，楊超，劉曉，蔡寶昌,

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023；4.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061；5.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061)

白術(shù)芍藥散(又名痛瀉要方)，為《丹溪心法》所載古方，是治療肝郁脾虛、腹痛泄瀉的代表方劑，有健脾疏肝、止痛止瀉的作用。該方由白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)4味中藥組成，方中白術(shù)健脾燥濕，為君藥；白芍調(diào)理肝脾，柔肝止痛，為臣藥；陳皮理氣燥濕，行氣止痛，健脾和中，為佐藥；防風(fēng)質(zhì)松而潤，祛風(fēng)之力較強，俱佐使之用[1]。白術(shù)芍藥散中的揮發(fā)性成分在治療疾病方面具有重要作用，白術(shù)中的蒼術(shù)酮、δ-雪松烯，白芍中的丹皮酚、9，12-十八碳二烯酸甲酯，陳皮中的D-檸檬烯，防風(fēng)中的人參醇都具有一定的相關(guān)藥理活性。白術(shù)揮發(fā)油能顯著抑制腫瘤生長，白芍揮發(fā)油中含有的丹皮酚具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，陳皮揮發(fā)油對胃腸道和氣管平滑肌的自發(fā)活動有抑制作用，防風(fēng)揮發(fā)油則有抗炎止血的作用[2-5]。

目前，白術(shù)芍藥散在臨床應(yīng)用及研究中存在飲片品類濫用的現(xiàn)象，尤其以生飲片代替炮制品進行組方最為常見[6-7]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為飲片經(jīng)過炒制可起到減毒增效的效果，眾多研究報道表明，炮制會使組方中各飲片成分發(fā)生變化，白術(shù)芍藥散各飲片中揮發(fā)性成分經(jīng)高溫炒制有所轉(zhuǎn)化或散失，一方面增加了藥物的焦香氣，增強其健脾和胃的效果，另一方面降低了揮發(fā)油含量，降低飲片燥性，減輕白術(shù)芍藥散治療疾病時的副作用[8]。飲片品類的濫用理論上會降低白術(shù)芍藥散治療脾胃疾病的效果，同時也不利于規(guī)范用藥。本實驗將生品飲片組成樣品(未炮制組)與炮制品飲片組成樣品(炮制組)水煎液揮發(fā)油成分種類及相對百分含量進行對比，模擬白術(shù)芍藥散最普遍劑型——湯劑，對揮發(fā)油樣品中化學(xué)成分進行鑒別分析，從物質(zhì)基礎(chǔ)角度探求炮制飲片組方的科學(xué)性及合理性。

1 材料

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890 A-5975C)、高速離心機(GENESPEED X1)、純水儀(MERCK MILLIPORE Aquelix 5)、JY601型精密電子天平(上海良平電子器材有限公司)。

1.2 試劑

無水硫酸鈉(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(質(zhì)譜級，上海ANPEL實驗器材有限公司)、超純水(實驗室制備)。

1.3 飲片樣品

白術(shù)生品飲片、白芍生品飲片、陳皮生品飲片、防風(fēng)生品飲片，廠家及批號見表1；蜜炙麩皮。各飲片經(jīng)南京海源中藥飲片公司丁斐按中藥鑒定師依照2015版《中國藥典》一部鑒定為正品[9]。

表1 藥材來源及批號

注：以上分組為EXCEL隨機數(shù)表生成。

2 方法

2.1 飲片炮制

按照2015年《中國藥典》中對飲片形狀的描述進行飲片炮制[9]。麩炒白術(shù)、麩炒白芍：將蜜炙麩皮撒入熱鍋內(nèi)(每100 kg白術(shù)片或白芍片，用蜜炙麩皮10 kg)，待冒煙時加入白術(shù)片或白芍片，中火炒至黃棕色、逸出焦香氣，取出，放涼，篩去蜜炙麩皮即可；清炒陳皮：鍋熱后，撒入生陳皮飲片，中火翻炒至陳皮顏色變深，質(zhì)脆，有香氣溢出，取出，放涼，篩去碎屑即可。防風(fēng)均以生品飲片入藥。

2.2 方劑配伍與煎煮

按照“1.3”項下飲片分組將生品飲片按白術(shù)120 g，白芍80 g，陳皮60 g，防風(fēng)80 g的比例混合組成未炮制組樣品6批；將“2.1”項下炮制后飲片同理按照與未炮制組對應(yīng)順序組成炮制組6批樣品。各組樣品飲片放入5 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量的超純水，浸泡30 min，煎煮1 h(大火煮沸后轉(zhuǎn)小火)。

2.3 揮發(fā)油提取

將“2.2”項下所得到的水煎液連同飲片按照2015年《中國藥典》四部中揮發(fā)油提取方式進行揮發(fā)油提取[10]，提取5 h后得揮發(fā)油采集至2 mL離心管中。取各組揮發(fā)油樣品，吸去下層水分，揮發(fā)油樣品中加入適量無水硫酸鈉脫水，吸取上層揮發(fā)油于1.5 mL離心管中，加入揮發(fā)油3倍量的甲醇，混勻后取1.5 mL樣品轉(zhuǎn)移至液相小瓶中，進樣。

2.4 色譜及質(zhì)譜條件

采用HP-VOC毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm×1.8 μm)，高純度氦氣載氣(>99.999%)，進樣口溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍m/z40～550，流速1 mL/min，分流比為30∶1。采用程序升溫，初始溫度為50 ℃，在此溫度下保持1 min，以15 ℃/min的速率升溫至120 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min的速率升溫至160 ℃，最后以15 ℃/min的速率升溫至240 ℃，在此溫度下保持5 min。

3 結(jié)果

各樣品GC-MS總離子流圖見圖1，將所得數(shù)據(jù)與NIST11數(shù)據(jù)庫和Wiley譜庫進行比對，通過查詢文獻、對比保留時間，篩選得到各樣品中存在揮發(fā)性成分，并運用面積歸一化法計算各組樣品中各成分的相對百分含量(表2)。炮制組及未炮制組樣品中測得揮發(fā)性共有成分145種，炮制后生成成分17種，消失成分15種(表3)。共有成分中包含多種類型成分，其中萜烯烴類及含氧萜烯類成分含量較高，占總成分的70%以上，具體相對百分含量較高的成分有D-檸檬烯、1-(1-formylethyl)-4-(1-butene-3-yl)-benzene、苯壬炔、棕櫚酸、人參炔醇等。因炮制及水煮等高溫過程，大部分成分含量均呈下降趨勢，符合傳統(tǒng)飲片炮制化學(xué)成分變化規(guī)律。

表2 GC-MS分析獲得炮制組與未炮制組共有揮發(fā)性成分信息表

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

(續(xù)表三)

(續(xù)表四)

注：UPB.未炮制組；PB.炮制組。

表3 飲片經(jīng)炮制后配伍新出現(xiàn)或消失的揮發(fā)性成分信息表

注：UPB.未炮制組；PB.炮制組?！?”表示未檢測出成分。

4 討論

本實驗從飲片炮制過程對復(fù)方化學(xué)成分的變化入手，緊密聯(lián)系臨床用藥，重點模擬白術(shù)芍藥散經(jīng)典劑型，結(jié)合化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)來說明古方中運用炮制品的合理性。實驗中共檢測出145種共有化學(xué)成分，其中白術(shù)揮發(fā)油中含有的γ-欖香烯、石竹烯、十三酸、脫氫異長葉烯、甘香烯、N，N-二甲基-2-苯并噁唑胺、4,4a,5,6,7,8-hexahydro-4,4a-dimethyl-6-(1-methyl vinyl)-2(3-hydrogen)-naphthol等成分，防風(fēng)揮發(fā)油中含量較高的紅沒藥烯、人參炔醇和棕櫚酸，陳皮揮發(fā)油中的D-檸檬烯、松油醇、松油烯，以及白芍揮發(fā)油中含量較高的正十五酸等成分均被檢測出[11-14]。經(jīng)炮制后大部分飲片揮發(fā)性成分含量降低，如桉葉醇、馬兜鈴烯、異愈創(chuàng)木醇等，其中以含量最高的D-檸檬酸降低最多，從炮制前的12.29%降低到10.07%。有機酸類在一定程度上有抗癌作用，炮制后組方中有機酸類成分含量的增加，可能使白術(shù)芍藥散具有提高癌細(xì)胞凋亡的能力[15-16]。飲片經(jīng)炮制后部分消失和生成的成分與前人報道一致[17]，炮制后新出現(xiàn)的成分中含量較高的為2(3H)-Naphthalenone(2.32%)及Pyrido[3,2-d]pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione(2.08%)。以上各成分的變化極有可能是古方中運用炮制品入藥而非生品的主要原因。

相對于已有報道，本實驗雖檢測出眾多新成分，但并未檢查出白術(shù)揮發(fā)油中含量較高的蒼術(shù)酮成分[16]，筆者推測是由于浸泡及煎煮過程中蒼術(shù)酮損失嚴(yán)重。蒼術(shù)酮與水易進行1，4加成反應(yīng)，白術(shù)原藥材在100 ℃的環(huán)境下10 min內(nèi)含量可降低80%。在煎煮的過程中，蒼術(shù)酮與水加速反應(yīng)轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ[18]，導(dǎo)致其含量降低至無法檢測。此外，麩炒同樣會在一定程度上減少飲片中蒼術(shù)酮含量[19]。

綜上，飲片是否炮制對白術(shù)芍藥散揮發(fā)性成分的組成具有一定影響，古籍中所載白術(shù)芍藥散應(yīng)采用炮制品入藥的科學(xué)性通過本實驗得以驗證，因此臨床中藥用藥規(guī)范化必須加以重視。