天花粉蛋白結(jié)合肽的篩選及潛在靶點(diǎn)蛋白的同源分析

趙峻，時(shí)磊，張芳

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)一直以來多用于臨床婦科疾病的治療，如宮外孕、葡萄胎、早或中期妊娠的引產(chǎn)等。TCS是從葫蘆科植物的塊栝樓根中分離純化得到的一種堿性蛋白，屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白。TCS成熟肽由247個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約24 000，pI=9.4，為不含糖的單鏈核糖體失活蛋白[1]。TCS可迅速引起胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞變性壞死，壞死細(xì)胞的崩解碎片充斥在絨毛間隙，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，然后加速絨毛組織退化壞死，造成胎兒死亡；同時(shí)，TCS引起的滋養(yǎng)葉細(xì)胞壞死，導(dǎo)致人體絨毛膜促性腺激素(HCG)和甾體激素迅速降低，絨毛及蛻膜組織變性及進(jìn)一步壞死，激發(fā)內(nèi)源性前列腺素的合成與釋放，繼而觸發(fā)宮縮、誘發(fā)流產(chǎn)。另外，TCS具有N2糖苷酶活性，能水解真核細(xì)胞核糖體28S rRNA 4 324位上腺苷酸的N-C糖苷鍵，使核糖體不可逆失活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。TCS的應(yīng)用范圍已涉及抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等方面[2-4]。TCS作為一種單鏈核糖體失活蛋白只有活性鏈而無細(xì)胞結(jié)合鏈，只能選擇性地進(jìn)入病毒感染的異常細(xì)胞內(nèi)，對(duì)正常細(xì)胞毒性很小，極具臨床應(yīng)用價(jià)值。TCS除對(duì)多種植物病毒有效以外，體外實(shí)驗(yàn)表明它對(duì)流感病毒、乙腦病毒、HIV病毒等也有抑制作用[3]。

TCS的作用靶點(diǎn)尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)以TCS為噬菌體篩選的底物，篩選TCS的結(jié)合肽，并通過蛋白質(zhì)同源性分析尋找其在體內(nèi)的潛在靶點(diǎn)，為TCS分子作用機(jī)制的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑、載體及菌株

IPTG/Xgal/四環(huán)素(上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：171104/160923/170512);TCS原料藥(上海金山制藥有限公司，批號(hào)：170106);E.coliER2738(NEB試劑盒)；噬菌體隨機(jī)十五肽庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；VCS-M13輔助噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀(Thermo公司)；搖床，PCR儀(德國(guó)eppendorf公司)；Tanon 2500凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；EPS 300電泳槽(上海天能科技有限公司)；ZHWY-211B搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；GSP-9080MBE隔水恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

2 方法

2.1 制備具有性纖毛的大腸桿菌雄性株TG1和ER2738

噬菌體通過結(jié)合大腸桿菌性纖毛進(jìn)行感染，將大腸埃希菌TG1從甘油凍存管內(nèi)平板劃線，接種于M9培養(yǎng)基平板，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h，4 ℃保存，1周內(nèi)使用。將ER2738劃線于LB-Tet平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，4 ℃保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

2.2 擴(kuò)增輔助噬菌體VCS-M13

將輔助噬菌體梯度稀釋，分別取10 μL加入到200 μL對(duì)數(shù)期TG1菌液中(OD600為0.4～0.6)，37 ℃水浴感染30 min后，加入到3 mL、42 ℃融化的H-TOP瓊脂中，然后鋪在溫?zé)岬腨TE平板上，冷卻后37 ℃培養(yǎng)過夜，待長(zhǎng)出M13噬菌斑。挑取M9平板上的TG1單克隆，接種于5 mL 2×YT培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)野生型M13噬菌斑接種到5 mL處于對(duì)數(shù)期的TG1培養(yǎng)物中，37 ℃搖床培養(yǎng)2 h后轉(zhuǎn)接到500 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后加入25 mg/mL卡納霉素，至終濃度50～70 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)8～16 h。10 800×g，4 ℃離心15 min，收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl(20%PEG，2.5 mol/L NaCl)，冰上放置30 min。再次10 800×g，4 ℃離心15 min，沉淀重懸于2 mL TE緩沖液中，0.45 μm膜過濾除菌。測(cè)定噬菌體滴度，將其稀釋至1×1012pfu/mL。分裝后置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 噬菌體隨機(jī)十五肽庫(kù)對(duì)TCS的篩選

取1 mL保存的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)(大約1×108pfu)接種到500 mL 2×YT培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL氨芐青霉素和1%葡萄糖)。37 ℃搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期(OD600為0.4～0.6)。取25 mL培養(yǎng)液，用輔助噬菌體VCS-M13感染，添加到470 mL 37 ℃預(yù)溫的2×YT培養(yǎng)基中,37 ℃水浴30 min。離心，沉淀重懸于30 mL 2×YT培養(yǎng)基中,并添加于470 mL 2×YT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。沉淀收集噬菌體，噬菌體保存液的滴度應(yīng)該在1010～1012pfu/mL之間。將TCS用包被液TBS稀釋為100 μg/mL，包被微孔板，4 ℃過夜。次日棄去未吸附抗原，加入200 μL 3%(w/v) BSA-TBS，37 ℃封閉1 h。棄封閉液，在每孔中加入100 μL新鮮制備噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)溶液，37 ℃孵育2 h。同時(shí)開始培養(yǎng)2 mL TG1，制備對(duì)數(shù)期TG1。棄未結(jié)合噬菌體，每孔加入200 μL 0.5%(v/v) Tween20-TBS洗滌，上下吹打5遍，等5 min后棄洗滌液，重復(fù)洗滌1次。第一輪篩選時(shí)，洗滌5遍；第二輪篩選時(shí)，洗滌10遍；第3輪篩選時(shí)，洗滌10～15遍。棄去最后的洗滌液后，每孔加入200 μL TBS，洗滌3次。然后每孔加入50 μL 100 mmol/L HCl-Glycine(pH=2.2)洗脫結(jié)合噬菌體并加入3 μL 2 mol/L Tris堿中和。將噬菌體溶液加入到2 mL新鮮制備的OD6000.4～0.6的E.coliTG1菌，室溫孵育30 min，測(cè)定輸出滴度。

2.4 噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)對(duì)TCS的篩選

具體的篩選步驟同隨機(jī)十五肽庫(kù)，區(qū)別在于購(gòu)買的肽庫(kù)為噬菌體肽庫(kù)，自身具有感染性，不需要輔助噬菌體幫助釋放。噬菌體擴(kuò)增方法如下:將噬菌體庫(kù)加入到20 mL ER2738培養(yǎng)物中(菌體應(yīng)當(dāng)處于對(duì)數(shù)前期)，37 ℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4.5 h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，然后4 ℃ 12 000×g離心10 min。將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積(約6 mL)的PEG/NaCl。讓噬菌體4 ℃沉淀過夜。4 ℃，12 000×g離心，去上清液。沉淀物重懸于1 mL噬菌體保存液1%(w/v) BSA-TBS中保存。

2.5 多克隆噬菌體ELISA檢測(cè)

用100 μL 100 μg/mL的靶分子包被ELISA板，陰性對(duì)照組包被TBS溶液，4 ℃過夜。去除包被液，每孔加滿封閉液(5%脫脂牛奶-TBS)，封阻1～2 h。去除封阻液，以0.05%Tween 20-TBS洗板3次，TBS洗板3次。每孔加入100 μL多克隆噬菌體(十五肽和十二肽4輪篩選后擴(kuò)增的噬菌體溶液)，室溫震蕩作用1～2 h。以0.05% Tween 20-TBS洗板3次，TBS洗板3次。同時(shí)用5%脫脂牛奶-TBS稀釋HRP-鼠抗M13抗體至0.1 μg/mL。每孔加入100 μL稀釋抗體，室溫震蕩作用1 h。以0.05% Tween 20-TBS洗板3次，TBS洗板3次，加入TMB溶液顯色。以50 μL稀硫酸(1 mol/L)終止反應(yīng)。測(cè)定OD450和OD650吸光值，并以O(shè)D450值減去OD650值，作為最后的檢測(cè)結(jié)果。

2.6 單克隆噬菌體ELISA

每一輪篩選過程中測(cè)定滴度的平板上挑選單克隆到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，擴(kuò)增單克隆噬菌體進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)方法如多克隆ELISA。

2.7 測(cè)序及序列同源性比對(duì)分析

將單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，十五肽庫(kù)用通用引物M13R測(cè)序，從貯存的96細(xì)菌培養(yǎng)板上，挑單克隆ELISA值較高的對(duì)應(yīng)克隆于1 mL LB中試管培養(yǎng)過夜。每個(gè)克隆對(duì)應(yīng)1支試管，將菌液直接送去上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。十二肽庫(kù)用試劑盒所提供的-96gIII測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序樣品準(zhǔn)備操作如下：挑單一藍(lán)色噬菌斑到ER2738過夜培養(yǎng)物中，37 ℃搖床培養(yǎng)4.5～5 h。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，離心30 s，將1 mL含噬菌體上清轉(zhuǎn)入新鮮離心管。加400 μL PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10 min。離心10 min，棄上清液。沉淀物徹底重懸于200 μL碘化物緩沖液中，加入500 μL乙醇。室溫溫育10 min。短時(shí)間的室溫溫育使單鏈?zhǔn)删wDNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。離心10 min，棄上清。用70%的乙醇洗沉淀，室溫干燥。沉淀重懸于20 μL雙蒸水中。將噬菌體單鏈DNA送去進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果利用PROSITE網(wǎng)站和BLAST網(wǎng)站在線搜索同源性較高的蛋白質(zhì)，并查閱文獻(xiàn)排除無關(guān)蛋白，確定可能的潛在靶點(diǎn)蛋白。

3 結(jié)果

3.1 4輪篩選噬菌體的富集

通過測(cè)定每一輪淘選洗脫的噬菌體滴度，計(jì)算每一輪噬菌體的輸入滴度和輸出滴度的比值來判斷噬菌體的回收率。從表1可以看出，十五肽庫(kù)噬菌體回收率隨輪數(shù)增加均呈遞增趨勢(shì)。而十二肽庫(kù)噬菌體回收率也有一定的遞增趨勢(shì)(表2)。由此判斷，與TCS特異性作用的高親和力噬菌體得到了有效富集，可以初步判斷篩選有效。

表1 隨機(jī)十五肽庫(kù)對(duì)TCS篩選的4輪富集結(jié)果

表2 隨機(jī)十二肽庫(kù)對(duì)TCS篩選的4輪富集結(jié)果

3.2 多克隆噬菌體ELISA檢測(cè)值

以TCS為靶抗原，進(jìn)行多克隆噬菌體ELISA，結(jié)果如圖顯示，其中圖1為隨機(jī)十五肽庫(kù)ELISA的結(jié)果，4輪噬菌體洗脫的親和力隨著輪數(shù)增加而逐漸增加，第4輪呈現(xiàn)最大的親和力；圖2為隨機(jī)十二肽庫(kù)ELISA的結(jié)果，前3輪噬菌體洗脫液的親和力隨著輪數(shù)增加而增加，第4輪有所下降，結(jié)果與試劑盒描述的一致，原因是第4輪擴(kuò)增的噬菌體非特異性占多數(shù)。進(jìn)一步證明篩選有效。

3.3 單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)值

以TCS為靶抗原，做單克隆噬菌體ELISA，結(jié)果如圖顯示，其中，圖3為隨機(jī)十五肽庫(kù)的ELISA結(jié)果，圖中橫坐標(biāo)1～3，4～6，7～9，10～12分別為1、2、3、4輪所挑出的單克隆，2、3、4輪都有親和力較高的克??；圖4為隨機(jī)十二肽庫(kù)的ELISA結(jié)果，圖中橫坐標(biāo)1～6，7～12分別為第2、3輪所挑出的單克隆，如圖所示，有較多的親和力高的單克隆。

圖3隨機(jī)十五肽庫(kù)單克隆噬菌體ELISA值

3.4 測(cè)序及序列同源性分析結(jié)果

結(jié)果見表3。

表3 與TCS具有較高親和力的肽段氨基酸序列

對(duì)上述篩選得到的親和力較高的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，這些克隆中多數(shù)克隆有完整的多肽序列，利用PROSITE網(wǎng)站將篩選得到的序列分別與已登記蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)有3條序列與蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位點(diǎn)具有同源性序列，PKC保守磷酸化位點(diǎn)的序列信息是：[ST]-x-[RK]，這3個(gè)序列分別為：十五肽庫(kù)里2個(gè)分別命名為D10和G8的序列，十二肽庫(kù)中1個(gè)命名為C6的序列。表3列出了經(jīng)過2個(gè)庫(kù)的篩選后親和力較高的噬菌體克隆所對(duì)應(yīng)多肽的氨基酸序列。其中，斜體的序列即為與PKC的磷酸化位點(diǎn)具有同源性的多肽序列。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，猜測(cè)PKC很有可能為TCS在體內(nèi)的潛在靶點(diǎn)蛋白。另外，經(jīng)過BLAST在線尋找序列相似性的蛋白質(zhì)，也能夠搜索出一系列與TCS作用機(jī)制相關(guān)蛋白,如核糖體蛋白L19，翻譯終止因子RF3,蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1等，但這些蛋白僅在搜索單一序列時(shí)出現(xiàn)。

4 討論

噬菌體展示技術(shù)作為一種新興的研究方法和工具，在尋找藥物靶點(diǎn)方面已被廣泛應(yīng)用[5]。在本試驗(yàn)中，用自行構(gòu)建的噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)和購(gòu)買的隨機(jī)十二肽庫(kù)分別對(duì)TCS分別進(jìn)行篩選[6]，2個(gè)庫(kù)均篩選出了一系列與TCS具有特異性結(jié)合的多肽鏈。從每輪噬菌體的回收率，4輪篩選所得噬菌體擴(kuò)增液的多克隆噬菌體ELISA結(jié)果和單克隆噬菌體ELISA結(jié)果都顯示出篩選有效，TCS結(jié)合噬菌體得到了有效的富集。利用PROSITE網(wǎng)站將篩選得到的序列分別與已登記蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)庫(kù)篩選均獲得與PKC的磷酸化位點(diǎn)一致的同源性序列。PKC是G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，其激活是脂依賴性的，需要膜脂DAG的存在，同時(shí)需要胞質(zhì)溶膠中Ca2+濃度的升高。當(dāng)DAG在質(zhì)膜中出現(xiàn)時(shí)，胞質(zhì)溶膠中的PKC被結(jié)合到質(zhì)膜上，然后在Ca2+的作用下被激活。已有文獻(xiàn)報(bào)道TCS能夠通過抑制PKC活性而誘導(dǎo)人慢性髓性白血病細(xì)胞株K562的細(xì)胞凋亡[7]，亦有報(bào)道TCS通過PKC/MAPK信號(hào)通路抑制人子宮頸癌細(xì)胞株HeLa的細(xì)胞增殖[8]，以及報(bào)道TCS通過在cAMP/PKC水平抑制腺苷酸環(huán)化酶活性來誘導(dǎo)HeLa的細(xì)胞凋亡[9]，TCS抑制抗CD3mAb誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)PKCα激活的研究結(jié)果，提示TCS誘發(fā)人體免疫低反應(yīng)是通過抑制淋巴細(xì)胞內(nèi)PKC激活而實(shí)現(xiàn)的[10]，另有研究表明PKC活性調(diào)節(jié)劑可以通過改變PKC活性，進(jìn)而影響TCS對(duì)K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。在TCS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程中，PKC抑制位于Caspase-3激活的上游[11]。TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制一直不明確，然而眾多文獻(xiàn)研究都表明，其分子作用機(jī)制與PKC有著明顯的聯(lián)系[12]。我們的研究進(jìn)一步顯示了TCS與PKC可能存在著直接的聯(lián)系。在后續(xù)研究中我們將通過分子間作用力分析如微量熱泳動(dòng)(Microscale thermophoresis,MST)等方法進(jìn)一步研究TCS和PKC之間的相互作用。