炮制對(duì)梔子抗抑郁作用的影響及其機(jī)制研究

吳浩然，黃曉燕，孫廣達(dá)，蔣睿智，單鑫，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

目前全球約有3.5億抑郁癥患者，抑郁癥帶來(lái)沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)并可導(dǎo)致自殺，每年因抑郁癥自殺死亡人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)人。抑郁癥的發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)到2020年將成為僅次于心臟病的第二大人類(lèi)疾病[1]。

情緒障礙在某些情況下被認(rèn)為是炎癥性疾病，有證據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子在重度抑郁患者和雙相情感障礙中均有所增加[2-4]。炎癥影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活。細(xì)胞因子導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激損害與情緒相關(guān)的大腦區(qū)域的膠質(zhì)細(xì)胞，如前額皮質(zhì)和海馬[5]。最近一項(xiàng)對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，社交失敗的易損性部分是由于前炎癥過(guò)程的增加和腹側(cè)海馬區(qū)[6]的血管重構(gòu)。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如NF-κB)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),可能會(huì)進(jìn)一步加劇抑郁癥狀[7]。循環(huán)中促炎細(xì)胞因子水平的升高以及伴隨而來(lái)的腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活已被證明在抑郁癥的形成中發(fā)揮了作用[8]。炎癥活化的中樞神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞以肥大和增殖為特征，細(xì)胞骨架膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)上調(diào)[9]?？傊?，抑郁和炎癥相互促進(jìn)，有明確的聯(lián)系[10]。

梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)。具有瀉火除煩、清熱利濕的功效[11]。郝文宇等[12]報(bào)道梔子粗提物能促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的成熟，有助于恢復(fù)抑郁小鼠海馬的結(jié)構(gòu)和功能。梔子苷是從梔子果實(shí)中提取的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，是其主要活性成分[13]，具有抗炎和抗氧化活性[14]。課題組前期對(duì)復(fù)方越鞠丸(梔子、川芎、香附、神曲、蒼術(shù))抗抑郁的研究中也發(fā)現(xiàn)，梔子是其發(fā)揮抗抑郁作用的關(guān)鍵性成分[15]。

目前《中國(guó)藥典》中載有生、炒、焦梔子3種制品[11]。梔子的炮制在古籍中早有記載，《丹溪心法》有“炒令十分有二分焦黑”及“炒黑”[16]等不同炮制程度的記載。但迄今為止，關(guān)于比較不同炮制品梔子抗抑郁作用的研究還很少，其中的生物學(xué)機(jī)制仍很復(fù)雜。因此，本研究以梔子的不同炮制品為對(duì)象，比較不同炮制品之間抗抑郁作用的差異，旨在尋找不同炮制品梔子抗抑郁作用差異的潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠60只,體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010，年齡6～8周。動(dòng)物房室溫為25 ℃，晝夜交替12 h，濕度為46%，動(dòng)物正常進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物程序均按照南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用專(zhuān)業(yè)委員會(huì)批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行。

1.2 藥物及試劑

生梔子(SZZ)購(gòu)自安徽億源中藥飲片科技有限公司，產(chǎn)地江西，批號(hào)：20180508。炒梔子(CZZ)、焦梔子(JZZ)藥材由南京中醫(yī)藥大學(xué)單鑫老師制得。將生、炒、焦梔子采用水煎煮的方法，經(jīng)過(guò)2次煎煮后，合并水煎液并濾過(guò)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水煎液濃縮成每1 mL含生藥量0.4 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝o藥持續(xù)2周。中藥制劑及載體灌胃給藥，劑量為每10 g小鼠體質(zhì)量灌胃0.1 mL(4 g/kg)。氟西汀(FLU，古田藥業(yè)，中國(guó))，溶于生理鹽水，腹腔注射20 mg/kg。RIPA裂解液、PMSF 100 mmol/L;一抗IL-1β(批號(hào)：AF5103)、TNF-α(批號(hào)：AF7014)均購(gòu)于Affinity公司、p-NF-κB p65(批號(hào)：3039)、NF-κB p65(批號(hào)：8242)、GFAP(批號(hào)：12389)、GAPDH(批號(hào)：5174)均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義矛華儀器設(shè)備有限公司)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(Tannon公司)，小鼠懸尾強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立與分組

建立慢性不可預(yù)知應(yīng)激性(CUMS)抑郁癥模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小鼠被單獨(dú)飼養(yǎng)，每天隨機(jī)接受1個(gè)應(yīng)激源。輕度應(yīng)激源包括:籠體45°傾斜24 h,24 h不進(jìn)食，24 h不飲水，濕墊24 h,50 mL管中約束6 h，夜間照明(每周夜間照明2次)。對(duì)照組(CON)小鼠(n=10)在正常條件下分組飼養(yǎng)。3周后，使用生、炒、焦梔子水提物,氟西汀或載體每日1次，共5組(n=10)，共2周。同時(shí)，對(duì)照組小鼠單獨(dú)使用載體給藥。

2.2 行為學(xué)測(cè)試

2.2.1 糖水偏好試驗(yàn) 在給藥24 h后進(jìn)行測(cè)試，預(yù)先禁食禁水24 h，在給藥的最后1 d，進(jìn)行行為測(cè)試。后將所有小鼠單籠放置，同時(shí)給予小鼠2%蔗糖水溶液與純水各1瓶，實(shí)驗(yàn)前稱取帶水瓶質(zhì)量，放置2 h后，再次稱量帶水瓶質(zhì)量。通過(guò)蔗糖溶液消耗量與總消耗量的比值來(lái)計(jì)算蔗糖消耗的比例。每7 d記錄1次糖水偏好試驗(yàn)。

2.2.2 懸尾試驗(yàn)[17]小鼠尾部用膠布固定。放在通用隔音行為箱內(nèi)，并倒掛于懸掛鉤上，保持其尾尖距膠布大約1 cm。小鼠為了擺脫不正常的體位而掙扎活動(dòng)，活動(dòng)一段時(shí)間即出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，表現(xiàn)出絕望狀態(tài)。記錄小鼠6 min內(nèi)的活動(dòng)情況，分析后4 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間作為絕望時(shí)間。

2.2.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 將每只動(dòng)物輕輕地放入1個(gè)高40 cm，直徑20 cm的透明圓柱形玻璃瓶中，裝滿水(23 ℃)，強(qiáng)迫游泳6 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用紙巾把小鼠擦干，放回籠子里。在6 min的測(cè)試時(shí)間里，計(jì)算小鼠在后4 min漂浮在水中的靜止時(shí)間。

2.3 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

小鼠在行為測(cè)試后被處死，在寒冷條件下，大腦組織立即被移除。整個(gè)海馬組織在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。依據(jù)GFAP、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)和核因子-κB(NF-κB)的蛋白分子量，選擇適當(dāng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA封閉1 h后,然后將膜分別放入預(yù)先加有一抗的抗體盒中，4 ℃冰箱搖床過(guò)夜。次日用TBST緩沖溶液洗膜3次，將PVDF膜分別放入加有對(duì)應(yīng)二抗的抗體盒中，搖床上室溫孵育1 h，ECL顯影。采集并分析目的蛋白條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同炮制品梔子水提物對(duì)小鼠糖水偏好的影響

造模3周及之后給藥期間，對(duì)照組小鼠均飲食正常，其余各組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在4 g/kg的生梔子、炒梔子和焦梔子處理2周后進(jìn)行多項(xiàng)行為測(cè)試。圖1顯示，與對(duì)照組相比，CUMS小鼠的糖水偏好顯著降低(P<0.01)，提示成功誘導(dǎo)抑郁樣行為。給藥2周后，炒梔子、焦梔子、生梔子和氟西汀組的糖水消耗量均顯著高于CUMS組(P<0.01)，炒梔子的改善效果最佳。

3.2 不同炮制品梔子水提物對(duì)小鼠懸尾測(cè)試的影響

在懸尾測(cè)試中，CUMS小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組小鼠(P<0.01)(圖2)。炒梔子和焦梔子給藥顯著縮短了CUMS小鼠在尾懸試驗(yàn)中的靜止時(shí)間(P<0.05)，氟西汀組不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.01)，生梔子組小鼠的不動(dòng)時(shí)間與CUMS小鼠無(wú)明顯區(qū)別。與焦梔子相比，炒梔子更好地縮短了CUMS小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

3.3 不同炮制品梔子水提物對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳測(cè)試的影響

CUMS小鼠與對(duì)照組相比，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中漂浮在水中的靜止時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)(圖3)。炒梔子和焦梔子給藥顯著縮短了CUMS小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)的靜止時(shí)間(P<0.05～0.01)，其中炒梔子的藥效最好，生梔子給藥無(wú)顯著改善。

3.4 不同炮制品梔子水提物對(duì)小鼠海馬炎癥水平的影響

圖4結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,CUMS小鼠海馬組織中促炎性因子IL-1β和TNF-α的水平顯著升高(P<0.01);與CUMS組相比,生、炒、焦梔子水提物處理后小鼠海馬組織中IL-1β水平均顯著降低(P<0.01),只有炒梔子顯著下調(diào)了CUMS小鼠的TNF-α水平(P<0.01)。

為了進(jìn)一步檢測(cè)不同炮制品梔子對(duì)炎癥水平的影響,我們還對(duì)小鼠海馬組織中與炎癥相關(guān)的p-NF-κB及NF-κB進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組相比,CUMS小鼠海馬組織中p-NF-κB的表達(dá)明顯升高(P<0.01);與CUMS組相比,3種炮制品水提物處理后，CUMS小鼠海馬組織中的p-NF-κB具有下降趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4IL-1β、TNF-α、p-NF-κB、GFAP在海馬中的表達(dá)情況

3.5 小鼠海馬組織中GFAP的表達(dá)情況

圖4結(jié)果顯示,相比對(duì)照組，CUMS顯著上調(diào)了GFAP的水平(P<0.01);與CUMS小鼠相比，炮制后的炒梔子和焦梔子顯著下調(diào)GFAP的活化(P<0.01)。這可能提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于炎癥的反應(yīng)性降低。生梔子處理并未出現(xiàn)顯著變化。

4 討論

CUMS模型使用模擬應(yīng)激源在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中誘導(dǎo)抑郁[18]，是一種被廣泛應(yīng)用的有效方法[19]。CUMS模型小鼠缺乏快樂(lè)，運(yùn)動(dòng)能力和探索能力下降[20]。在CUMS小鼠模型中，行為測(cè)試缺陷是一種明顯的癥狀，表現(xiàn)為不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，蔗糖攝入量減少[21]。本研究中，炒梔子和焦梔子給藥后的小鼠糖水偏好顯著高于CUMS組(P<0.01)。同時(shí)，炒梔子和焦梔子也顯著縮短了CUMS小鼠在懸尾試驗(yàn)(P<0.05)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)(P<0.05～0.01)的不動(dòng)時(shí)間。生梔子對(duì)懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間均無(wú)顯著改善，但具有下調(diào)趨勢(shì)。在我們的研究中，氟西汀在2周后顯示出抗抑郁效果，而4 g/kg的炒梔子和焦梔子與其作用類(lèi)似。以上結(jié)果說(shuō)明，不同炮制品梔子水提物對(duì)CUMS小鼠具有抗抑郁作用，且炒梔子和焦梔子的藥效優(yōu)于生梔子，其中以炒梔子最強(qiáng)。

CUMS小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的同時(shí)也伴隨著海馬炎癥水平的升高。重度抑郁患者的IL-1β水平升高，且與抑郁癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[22]，而缺乏IL-1受體的小鼠在承受長(zhǎng)期壓力后，能夠抵抗抑郁樣行為的發(fā)生[23]，抗抑郁藥物相應(yīng)降低了IL-1β水平[22]。在本研究中，與CUMS小鼠相比，炒、焦、生梔子水提物處理后小鼠海馬組織中IL-1β水平均顯著降低(P<0.01),只有炒梔子顯著下調(diào)了CUMS小鼠的TNF-α水平(P<0.01)。3種炮制品水提物處理后，CUMS小鼠海馬組織中的p-NF-κB均具有下降趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。炎癥活化的中樞神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞以肥大和增殖為特征，細(xì)胞骨架GFAP表達(dá)上調(diào)[9]。本研究中，CUMS小鼠的GFAP水平在海馬組織中顯著升高。由此我們認(rèn)為，海馬炎癥水平的升高預(yù)示著反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生[24]，以及海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而反映出神經(jīng)元的功能失調(diào)。炮制后的炒梔子和焦梔子顯著下調(diào)CUMS小鼠GFAP的活化(P<0.01)，生梔子無(wú)改善作用。不同炮制品梔子水提物能夠顯著下調(diào)CUMS小鼠的炎癥水平，其中以炒梔子的抗炎作用最強(qiáng)。

綜上所述，應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥過(guò)程存在于腦中，且CUMS小鼠在行為學(xué)中延長(zhǎng)的不動(dòng)時(shí)間與腦部的炎癥密切相關(guān)。不同炮制品梔子水提物可以不同程度地下調(diào)CUMS小鼠海馬的炎癥水平，這可能是其產(chǎn)生抗抑郁作用并存在作用差異的機(jī)制之一。