長鏈非編碼RNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制中的作用△

王中原 孫勁禹 謝田華 殷麗 姚勇

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的眼部并發(fā)癥，是導致成年人失明的重要原因[1]。DR的發(fā)展伴隨血管滲漏、黃斑水腫以及新生血管形成等病理過程。目前DR發(fā)病機制有諸多學說，包括多元醇通路激活、糖基化終末產(chǎn)物過量生成、氧化應(yīng)激、蛋白激酶C活化和生長因子表達增加等[2]。這些機制共同導致DR患者視網(wǎng)膜微血管病變以及視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的功能障礙和退化。但目前人們對DR的發(fā)病機制仍未完全明確，臨床上對DR尚不能有效地預防和治療。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一類核苷酸數(shù)大于200且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，是基因表達的重要調(diào)控因子，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其基因組位置，lncRNA可分為5種類型：基因間區(qū)lncRNA、增強子lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、天然反義轉(zhuǎn)錄本(natural antisense transcripts,NATs)和假基因[3]。研究顯示，DR發(fā)生中存在大量異常表達的lncRNA，涉及軸突引導、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、趨化因子信號通路、丙酮酸代謝等多個通路[4]。這些信號通路與神經(jīng)退行性病變、新生血管形成異常、炎癥等病理過程相關(guān)，提示lncRNA在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本文將對目前DR相關(guān)lncRNA的基因組起源以及其在DR發(fā)生發(fā)展中的分子機制及調(diào)控作用進行綜述。

1 lncRNA調(diào)控細胞凋亡

DR以血管病變和黃斑水腫為特征，伴有血管和神經(jīng)元的變性，這種變性往往伴隨細胞凋亡。Müller細胞作為視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細胞，為視網(wǎng)膜神經(jīng)元提供能量代謝所需的結(jié)構(gòu)支持和能量，在視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生長、損傷、修復和再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。lncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction associated transcript,MIAT)主要在心臟和腦組織中表達，lncRNA MIAT異常表達參與心肌梗死、微血管功能障礙、糖尿病等多種疾病的細胞增殖、凋亡和遷移[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病鼠模型中Müller細胞內(nèi)MIAT表達增加，并與核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活密切相關(guān)。MIAT能夠結(jié)合并直接抑制miR-29b，間接促進下游蛋白Sp1的表達增加，進而調(diào)控Müller細胞的凋亡[9]。此外Yan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠增加活化caspase-3蛋白水平，并且下調(diào)磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)水平。敲除MIAT能夠部分逆轉(zhuǎn)下調(diào)的磷酸化Akt，并且下調(diào)caspase-3的增高幅度,發(fā)揮減少視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用。

核旁組織轉(zhuǎn)錄本1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1 )是一種定位于核旁核顆粒的新型lncRNA，能夠維持核旁核顆粒的空間結(jié)構(gòu)，在肺癌、食管癌和胃癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)[10-12]。miR-497是NEAT1的潛在靶點，其3’-UTR區(qū)存在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor anti-sense,BDNF)結(jié)合位點。BDNF在維持視網(wǎng)膜神經(jīng)元功能和再生方面具有重要作用，來自Müller細胞的BDNF可以保護光感受器和神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，是預防糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的關(guān)鍵[13]。實驗顯示，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NEAT1明顯下調(diào)，而miR-497在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和高糖刺激的Müller細胞中顯著升高。綜上所述，下調(diào)的NEAT1通過負調(diào)控上調(diào)miR-497，降低BDNF的表達，從而促進Müller細胞凋亡，加重DR[14]。

BDNF反義長鏈非編碼RNA (brain derived neurotrophic factor-antisense long non-coding RNA,BDNF-AS)是近年來發(fā)現(xiàn)的天然反義lncRNA，在多種人體組織中自然表達，通過改變BDNF位點的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)抑制BDNF RNA轉(zhuǎn)錄[15]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡，并觀察到BDNF-AS的上調(diào)以及BDNF下調(diào)。靶向BDNF-AS的小干擾RNA可以改善視網(wǎng)膜色素上皮細胞的凋亡，并恢復BDNF的表達水平[16]。因此，BDNF-AS通過對BDNF的反向調(diào)控誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡。

2 lncRNA調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖

血管內(nèi)皮細胞是高血糖損害的主要靶細胞，在糖尿病中發(fā)生通透性增加、重塑和表型改變等變化。DR中血管生成涉及多種血管活性因子，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號是主要的限速步驟。然而，VEGF的產(chǎn)生可能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)控[17-18]。

在細胞周期激酶抑制因子4(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4,INK4)基因座中，反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)定位于9q21染色體上。lncRNA ANRIL可能具有直接的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)或間接的作用，如招募染色質(zhì)重塑復合物多梳抑制復合物2 (polycomb inhibitor complex 2,PRC2)到特定的基因組位點，實驗證明過表達ANRIL也可以調(diào)節(jié)組蛋白乙?；蜃觩300[19-20]。PRC2以及其對組蛋白3上27位賴氨酸的甲基化在正常發(fā)育和惡性腫瘤的表觀遺傳學調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PRC2復合物有4個核心亞基：EZH2 (enhancer of zeste homolog 2)、SUZ12(suppressor of zeste 12 homologue)、EED (embryonic ectoderm development)和RbBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4 and 7)，其中EZH1/2具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性并受到SUZ12和EED調(diào)節(jié)[21]。實驗表明，高糖刺激的內(nèi)皮細胞中ANRIL、ANRIL-P300和PRC2表達均顯著上調(diào)，ANRIL敲除可以逆轉(zhuǎn)相關(guān)上調(diào)蛋白[22]。并有研究報道，DR中miR200b直接或在p300和(或)PRC2復合物調(diào)控下調(diào)節(jié)VEGF的產(chǎn)生[23]。綜上所述，ANRIL與p300、EZH2直接結(jié)合，間接調(diào)控miR200b來增加VGFR表達水平，促進內(nèi)皮細胞增殖。

視網(wǎng)膜非編碼RNA3 (retinal non-coding RNA3,RNCR3)又稱LINC00599，是一種基因間非編碼RNA，Petri等[24]首次報道lncRNA RNCR3在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中動態(tài)的表達，具有潛在調(diào)控神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化的功能。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(krüppel-like transcription factor 2,KLF2) 具有調(diào)節(jié)血管張力、血管形成、維持血管穩(wěn)態(tài)的作用。有研究表明，RNCR3作為一種競爭性內(nèi)源RNA發(fā)揮作用，并與KLF2和miR-185-5p形成反饋回路，調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化中的血管生成障礙[25]。研究者首先在高糖刺激的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中同時觀察到RNCR3和KLF2的表達增加。實驗進一步發(fā)現(xiàn)注射miR-185-5p類似物可以降低內(nèi)皮細胞中RNCR3和KLF2的表達水平，并抑制內(nèi)皮細胞增殖，而敲除RNCR3可減輕視網(wǎng)膜血管功能障礙。因此推斷，RNCR3通過RNCR3/KLF2/miR-185-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖[26]。Yan等[7]發(fā)現(xiàn)，MIAT也可作為競爭性內(nèi)源RNA，與VEGF和miR-150-5p形成反饋回路，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖。

長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)最先在肺癌的轉(zhuǎn)移中報道[27]。有研究報道，內(nèi)皮細胞缺氧可增強lncRNA MALAT1的表達，促進內(nèi)皮細胞的增殖反應(yīng)，基因敲除或藥理抑制可降低體內(nèi)血管生長[28]。在鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠中，MALAT1表達顯著上調(diào)，而MALAT1的下調(diào)可以顯著改善周細胞丟失、毛細血管變性、微血管滲漏和視網(wǎng)膜炎癥等現(xiàn)象。MAPK信號通路常被許多細胞外刺激激活，包括高糖應(yīng)激。MAPK活化具有凋亡、細胞增殖、有絲分裂和多種基因轉(zhuǎn)錄等生理效應(yīng)。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中MALAT1的下調(diào)可以顯著改變磷酸化p38-MAPK的水平，p38-MAPK通路抑制劑可以阻斷MALAT1誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖。Liu等[29]研究表明，MALAT1通過p38-MAPK信號通路調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的過度增殖。lncRNA HOXA末端轉(zhuǎn)錄本(lncRNA HOXA transcript at the distal tip,HOTTIP)是一種從HOXA家族轉(zhuǎn)錄而來的非編碼RNA，在糖尿病大鼠和小鼠的視網(wǎng)膜中觀察到HOTTIP顯著上調(diào)[30]。下調(diào)HOTTIP導致p38-MAPK通路失活，并減少糖尿病引起的視網(wǎng)膜細胞視覺功能下降和凋亡。綜上所述，HOTTIP也能通過p38-MAPK通路促進糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變。

FOXF1鄰近非編碼發(fā)育調(diào)控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA,FENDRR)位于染色體3q13.31上，是一種長達3099 bp的新型lncRNA。FENDRR從叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子F1(forkhead box transcription factor F1,FOXF1)的啟動子中分離轉(zhuǎn)錄，并與FOXF1共表達[31]。有研究報道，過表達FENDRR能夠上調(diào)FOXF1的表達，反之亦然[32]。內(nèi)皮基因是血管內(nèi)皮生長因子信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵基因，F(xiàn)OXF1通過調(diào)控內(nèi)皮基因參與胚胎血管的形成[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血漿中FENDRR和VEGF表達均升高，并且FENDRR過表達可顯著促進VEGF表達升高，高糖誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖、遷移、毛細血管形態(tài)發(fā)生改變，F(xiàn)ENDRR基因的敲除后則產(chǎn)生了相反的效果[34]。綜上所述，lncRNA FENDRR通過與FOXF1共表達調(diào)控VEGF表達水平促進高糖誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖和血管生成。

lncRNA母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)是位于染色體14q32.3，DLK1-MEG3印跡位點的非編碼轉(zhuǎn)錄本。研究發(fā)現(xiàn)，相對于健康人，DR患者血清lncRNA MEG3水平顯著降低,而血清VEGF和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平明顯升高。在高糖誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞株中過表達MEG3能夠抑制TGF-β1和VEGF表達的增加。因此，推斷MEG3也參與到TGF-β1/VEGF調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖的網(wǎng)絡(luò)中[35]。

3 lncRNA參與炎癥反應(yīng)

炎癥是機體防御的先天免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)通過與特定受體結(jié)合來識別外來病原體或抗原，導致細胞因子的激活并誘導促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。視網(wǎng)膜血管炎癥反應(yīng)可由多種因素引起，如高血糖、生長因子、糖基化終末產(chǎn)物、循環(huán)或玻璃體細胞因子以及趨化因子水平升高等。在DR患者的眼部微環(huán)境中，促炎分子的過表達以及持續(xù)性炎癥是DR啟動和進展的關(guān)鍵[36]。

lncRNA沉默信息調(diào)節(jié)劑1 (silent information regulatory 1,SIRT1)被報道與細胞凋亡和炎癥相關(guān)，并由miR-34a調(diào)控，而lncRNA SIRT1可以通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和NF-κB通路抑制炎癥和凋亡[37-38]。實驗顯示，高糖抑制MEG3和SIRT1表達，增強miR-34a表達[39]。MEG3過表達能夠下調(diào)miR-34a，間接促進SIRT1蛋白表達水平增加同時抑制高糖誘導的白細胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎性因子分泌。實驗發(fā)現(xiàn)，高糖能夠促進IκB和NF-κB形成異二聚體，并且miR-34a類似物能夠提高這種效應(yīng)。但MEG3的過表達或miR-34a的下調(diào)能通過上調(diào)SIRT1部分逆轉(zhuǎn)這種表達模式。綜上所述，MEG3可以通過靶向miR-34a / SIRT1軸抑制NF-κB信號通路，進而減輕高糖誘導的炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細胞是視網(wǎng)膜中主要的先天免疫細胞，能夠調(diào)節(jié)炎癥過程。研究發(fā)現(xiàn)，敲除MALAT1能夠通過p38/MAPK信號通路阻止視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的過度增殖，改善視網(wǎng)膜炎癥[29]。Amadori 糖化白蛋白(amadoriglycated albumin,AGA)是循環(huán)糖化白蛋白的主要形式。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在DR患者的纖維血管膜中顯著上調(diào)，誘導了DR的微血管紊亂[4]。實驗發(fā)現(xiàn)，注射MALAT1 shRNA能夠下調(diào)MALAT1，并抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的釋放。AGA處理后視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞釋放MCP-1呈劑量依賴性和時間依賴性，并且AGA處理的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達水平也持續(xù)升高。轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA后，AGA誘發(fā)的MCP-1釋放增加被顯著抑制。綜上所述，AGA能夠通過MALAT1誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放趨化因子MCP-1[40]。已有研究報道，AGA通過miR-124誘導小膠質(zhì)細胞活化和炎癥反應(yīng)[41]，而StarBase v2.0軟件預測發(fā)現(xiàn)MALAT1可以與miR-124形成堿基互補配對[42]。因此，推斷MALAT1可能發(fā)揮競爭性RNA的作用。已有實驗表明，大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中，miR-124通過直接結(jié)合MCP-1的3’-UTR控制MCP-1的表達[43]。而在小膠質(zhì)細胞中，熒光素酶報告基因檢測實驗表明miR-124也能直接靶向MCP-1。進一步的生物信息學分析和熒光素酶報告分析證實MALAT1能夠直接結(jié)合miR-124，在MALAT1 shRNA存在的情況下，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜裂解液中miR-124水平升高。這些數(shù)據(jù)提示，MALAT1作為競爭性RNA負性調(diào)節(jié)miR-124的表達。最后蛋白印跡實驗表明MALAT1敲除后，AGA處理的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞MCP-1水平顯著降低，但反義miR-124(anti-miR-124)能夠逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。綜上所述，MALAT1/miR-124/MCP-1信號通路可能參與AGA誘導的小膠質(zhì)細胞MCP-1表達。

巨噬細胞能夠持續(xù)TGF-β1促進炎癥反應(yīng)的發(fā)展。在DR患者的房水中已檢測到TGF-β1的高表達，而TGF-β信號的激活介導的炎癥反應(yīng)能夠促進糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[44-45]。研究表明，在DR患者血漿以及視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中MIAT的表達增高，皮爾森相關(guān)系數(shù)分析表明血漿中上升的MIAT和TGF-β1與DR存在顯著的相關(guān)性，但是在未發(fā)生DR的糖尿病患者中未發(fā)現(xiàn)MIAT和TGF-β1的關(guān)聯(lián)[46]。進一步在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中過表達MIAT，能夠顯著上調(diào)TGF-β1的蛋白表達水平。綜上所述，lncRNA-MIAT可能通過活化TGF-β信號通路促進DR的發(fā)展。

4 lncRNA參與間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮細胞膜表型向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)換稱為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT分為3型: 1型EMT發(fā)生在胚胎和發(fā)育階段，2型和3型EMT在出生后仍然活躍，參與慢性炎癥和惡性腫瘤的纖維化。間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial to mesenchymal transition,EndMT)被認為是EMT的一個子類，也表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞標志物和功能表達降低，同時間充質(zhì)標志物和功能表達增加[47]。在高糖環(huán)境中，內(nèi)皮細胞經(jīng)歷一系列的細胞內(nèi)事件促進EndMT的發(fā)生。受損的內(nèi)皮細胞表達肌成纖維細胞分化特征的標志物，例如α-平滑肌肌動蛋白和平滑肌22α蛋白，從而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型，同時內(nèi)皮細胞標志物如鈣黏蛋白和CD31則表達減少。與EMT類似，TGF-β超家族通過活化Smad、MEK、PI3K、p38、MAPK等下游信號分子調(diào)控EndMT[48]。H19基因是父系印跡，產(chǎn)生一個2.3 kb的lncRNA H19。lncRNA H19主要定位于細胞質(zhì)，由位于同一位點的母系印跡基因胰島素樣生長因子2調(diào)控[49]。實驗表明，高糖誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中H19表達降低，伴隨著內(nèi)皮標記物的顯著下調(diào)，間充質(zhì)標記物的上調(diào)。在高糖環(huán)境下，H19過表達能夠逆轉(zhuǎn)EndMT，并且還能增加葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中miR-200b下調(diào)。病理情況下miR-200b能夠介導EndMT[50]，然而過表達miR-200b對H19的水平?jīng)]有影響。糖尿病鼠和H19基因敲除小鼠在不使用胰島素的情況下進行長達2個月的喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞表型減少，間充質(zhì)表型增加，并且血管滲漏也更加嚴重。高糖刺激能夠使視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中TGF-β1表達增加，但過表達H19后這種現(xiàn)象被明顯抑制。有趣的是，在使用了miR-200b抑制劑后，TGF-β1的表達量依然因為過表達H19而降低，這表明H19能夠以不依賴miR-200b的方式調(diào)控TGF-β1。液相芯片分析內(nèi)皮細胞溶解物相對量化的磷酸化和總TGF-β信號蛋白時發(fā)現(xiàn)，表達的或磷酸化的TGF-βRII、smad2、smad3、smad4、p-Akt和p-ERK1/2蛋白增加。過表達H19發(fā)現(xiàn)，蛋白smad2、smad3、smad4和p-Akt的表達量都沒有變化，但TGF-βRII和p-ERK1/2的表達水平都降低，蛋白印跡法也顯示同樣的結(jié)果。因此，H19通過調(diào)控TGF-β2/MAPK/(ERK1/2)信號通路抑制高糖介導的EndMT[47]。同時有研究證實，H19也可以通過增加上游組蛋白乙?；瘉砀淖僲iR200通路逆轉(zhuǎn)EMT[51]。綜上所述，H19可通過多種途徑影響視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

5 展望

盡管報道的數(shù)量有限，但是在分子生物學領(lǐng)域，對于闡明lncRNA調(diào)控DR發(fā)生發(fā)展的信號網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)取得了重大突破。這些與DR發(fā)病機制相關(guān)的特異性lncRNA可能作為診斷DR潛在的生物標志物和治療靶點。例如，根據(jù)小RNA分子特異性結(jié)合互補序列的特性，利用RNA干擾技術(shù)可以抑制lncRNA靶點的表達。動物實驗已證實，基于siRNA的治療方法可以抑制癌癥和其他疾病的基因表達，且沒有顯著的毒性，目前正在進行臨床試驗[52]。但此療法也存在lncRNA空間結(jié)構(gòu)復雜，siRNAs目標親和力低，不穩(wěn)定等缺陷。

因為lncRNA在疾病發(fā)病機制中的特殊作用，lncRNA也可以作為疾病狀態(tài)的標志物，輔助疾病的診斷。例如血漿lncRNA-MIAT水平可以作為DR診斷的生物標志物，ROC曲線分析表明以健康對照組為參照，曲線下面積為0.8896，95%可信區(qū)間為 0.829 7～0.949 5[46]。但目前此類方向的研究報道不多，聯(lián)合運用多種高特異性的lncRNA作為生物標記物能夠提高DR預測，診斷以及預后的靈敏度和特異度。

此外，lncRNA和miRNA都在DR的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，但是DR中l(wèi)ncRNA和miRNA之間的相互作用仍不太清楚，尤其是lncRNA作為競爭性RNA結(jié)合miRNA調(diào)控靶基因表達的分子機制。已有研究構(gòu)建出DR中競爭性的內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)[53]，相信攻克這一難關(guān)對完全了解DR的發(fā)病機制會有重大意義。